Minta-előkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC), 44. rész: A proteomika igényei szerint.

Sorozatunkat – annak idején – azzal a szándékkal indítottuk, hogy az elválasztástechnikát, ezen belül is a kromatográfiát, ok-okozati összefüggéseken keresztül ismertessük meg a kedves olvasóval. Az előbbiek szellemében azután igyekeztünk úgy ismertetni a folyadékkromatográfia rejtelmeit, hogy az mentes maradjon mindenféle misztifikálástól. Ennek megfelelően nemcsak sorozatunk főcímében neveztük témánkat minta-előkészítésnek, de amikor csak módunk volt erre, még tovább is hangsúlyoztuk, hogy az analitikai feladatok kérdésére adandó választ valamilyen spektroszkópiai technika alkalmazásával kaphatjuk meg, és a kromatográfiát – legalábbis az elválasztó/sorbarendező folyamatát – minta-előkészítésnek tekintjük. Ennek a megállapításnak a szellemében, és rendszeres hangoztatásával azután a multidimenzionális folyadékkromatográfia ismertetésén keresztül eljutottunk a folyadékkromatográfia minta-előkészítéséhez (is), amit az alkalmazott megközelítésünk szellemében a minta-előkészítés minta-előkészítésének kell tehát nevezni. Alkalmazásának okaként a vizsgálati minta összetettségét jelöltük meg. A jelenséget pedig „A halász és az aranyhal” történetével igyekeztünk karikírozni, amikor is a halász feleségét az analitikai probléma felvetőjének, a halászt az analitikusnak, az aranyhalat pedig az elválasztástechnika inventorának aposztrofáltuk.

Nos a biológia – elsősorban sejtbiológia – aztán igencsak komoly igényekkel lépett fel az analitikai technikák fejlesztőivel szemben. Mondhatnánk, a létező legkomolyabbakkal. Tessék szíves lenni magunkat, a belsőnket vizsgálni kémiailag, hogy tisztába kerülhessünk a fiziológiánk és patológiánk jelenségeinek sejtbiológiai hátterével, alapjaival. Kegyetlen, de jogos kívánság. Igazi 21. századi kívánság! És az „aranyhal” cselekedett! Előbb a genetikai állomány került feltérképezésre, „szállította a módszereket”, azután – az előbbiből következően – a fehérjé(in)k kutatásában nyújtott segítséget a kialakult érdeklődésünknek megfelelően. A keletkezett eredmények minősége és mennyisége alapján az elmúlt évtizedet a molekuláris biológia nagy áttörése, mondhatni ugrásszerű fejlődése jellemezte. A világmindenség jelenleg ismert legösszetettebb egysége, a sejt életének molekuláris szintű megismerése nemcsak – minden korábbinál részletesebb módon – elkezdődött, illetve inkább folytatódott, de folyamatosan szolgáltatta az újabb és újabb felismeréseket. Mielőtt ennek a napjainkban egyre szélesebb területet felölelő folyamatnak néhány elválasztástechnikai érdekességéről meditálnánk, feltétlenül hangsúlyoznunk kell, hogy a kémiai/biológiai analitika technikailag hiába fejlődött volna még fantasztikusabban is, ha az egyre több – és ezért már szinte egyre áttekinthetetlenebb – eredmény feldolgozására nem állt volna rendelkezésre a számítástechnika. De „szerencsére” állt, és ez lehetővé tette, hogy a kémiai analitika – sokszor valóban áttekinthetetlen – eredményhalmazából, a molekuláris biológia számára következtetéseket vonhassanak le azok, akik a megfelelő biológiai ismereteik alapján ezt megtehették. Természetesen egyre inkább nem magányos kutatóként, akikről annyi szép történet született a múltban, hanem egyre inkább csapatjátékosként. Már csak ezért is hivatkozni kell azokra a számítógépes könyvtárakra, amelyek kialakítása, majd felhasználása nélkül az említett információátmenet a kémiai analitikából a molekuláris biológiába ennyire eredményesen nem következhetett volna be, mert ezeknek a kialakítása mögött minden esetben igencsak népes csapat áll, illetve eredendően állt. Ez egyben igen szép és látványos példa a különböző tudományterületek művelőinek eredményes együttműködésére.

Az emberi genetikai állomány „teljes” megismerésének céljából alapították a Human Genetic Projectet, a HUGO-t. Ennek célkitűzéseként – nemzetközi összefogással – feltérképezték az ember sejt genetikai állományát. A legigazibb emberi tulajdonság, az örök emberi kíváncsiság azonban ezúttal sem hagyta nyugodni a kutatókat, biológusokat, és ezért megalapították a Human Proteome Projectet, a HUPO-t. Ennek  célkitűzése az emberi sejt(ek) fehérjeállományának a feltérképezése. A célkitűzés első pillanatra a laikusok számára hasonlónak látszik. Feltérképezés, feltérképezés, nahát. Pedig micsoda különbség, és nemcsak kémiai ez a különbség, hanem mennyiségi is. Mintha San Marino és Kína térképének az elkészítését hasonlítanánk össze. Ráadásul, amíg a 20000–30000 gént tartalmazó emberi genom gyakorlatilag statikusnak tekinthető, addig a fehérjék száma egy sejtben nemcsak 50000–500000 lehet, de ez a szám állandóan változhat a különböző környezeti hatások okán. Tehát míg a genetikai állomány egy emberi sejtben annyi, amennyi, és ez is állandó érték, addig a fehérjék száma nagyságrendekkel lehet több, és ez a szám külső hatásra még változhat is. Tehát a fehérjék mennyisége dinamikusan változónak tekinthető. Éppen ez az egyik érdekessége a proteomika analitikájának, hogy ezt a változást nyomon kövesse. De ez nem minden, már ami a proteomika jellegzetességeit illeti. Egy sejt fehérjéinek mennyisége hat nagyságrenddel is különbözhet egymástól. Ráadásul úgy, hogy a kevesebb az érdekesebb. Más szóval nemcsak a kevesebbet kell észrevenni és analizálni, de úgy, hogy a több – az anynyit emlegetett mátrix részeként – csak zavarja a vizsgálatokat. A fehérjék – a géneket lényegesen meghaladó – nagy száma egyébként abból fakad, hogy a sejtfehérjék jelentős része, a megfelelő funkciós csoportjukon, úgynevezett poszttranszlációs módosulást szenved el. Ezek a módosulások:

•          foszforilálást,
•          acetilálást,
•          szulfonálást és
•          glukozilálást

jelentenek. A fehérjék szerkezetében bekövetkezett változások természetesen az adott fehérje viselkedésében okoznak változást. Bizonyos fehérjék egyébként biológiai szintézisük után akkor alakulnak aktív molekulává, amikor bizonyos hidrolitikus enzim hatására hidrolízist szenvednek. Ezek a hidrolízisek a proenzim › enzim átalakulások. Tehát az ún. postgenomikus folyamatok okozzák a proteomika dinamizmusát, amelyek – mint már említettük – „izgalmasabbá”, érdekesebbé, de analitikailag nehezebbé teszik a proteomikát a genomikánál. Ezt fokozandó még azt is meg kell állapítanunk, hogy a sejtben található fehérjék, tehát a proteomika elemei között több, akár hat nagyságrendnyi mennyiségi különbség lehetséges. Ezért bizonyos kis gyakoriságú fehérje izolálása olyan egyenértékű analitikai feladat lehet, mint a tű keresése egy szénakazalban.

Akinek még ennyi riasztó körülmény sem elegendő a proteomika analitikájától való elrettentéshez, annak eláruljuk, hogy az említett elemek között – a dolog természeténél fogva – lényeges oldhatóságbeli különbségek léteznek. Egy sejtben egy időben ugyanúgy megtalálhatóak hidrofób és hidrofil jellegű fehérjék. Persze nem egymás közelében, ezzel is mutatva egy sejt összetett szerkezetét és funkcióját. Egy sejt alapvetően vizes, tehát hidrofil rendszer. A vízben nem oldható fehérjék elkülönülve alkotnak különböző membránrendszereket a sejten belül, illetve alkotják a sejt vázrendszerét. Mindezek azonban résztvevői az adott sejt életének. Csellengő, „munkanélküli” fehérjemolekulák a sejtekben sem léteznek. Ezt a luxust egyetlen sejt sem engedheti meg magának és a szervezetnek, amelynek élő egységei. Egy sejt tehát felépítésében és működésében is összetett képződmény. Ez az összetettség azonban pontosan annyira bonyolult számunkra, amennyire ezt a megszerzett ismereteink hiányossága okán    – tehát kényszerűségből – annak kell tekintenünk. Az ismeretek bővítése és esetleges korrekciója azonban nem képzelhető el a megfelelő analitika nélkül. Az előző mondatokkal igyekeztünk arra utalni, hogy a proteomika analitikája sziszifusziként jellemezhető. Ezzel szemben a proteomika szinte maga az életünk molekuláris lényege. Így azután a kutatók nem ismerik a lehetetlen jelzőt, amikor a proteomika analitikai technikáiról „szól a történet”.

A fehérjék „egyszerű” katalogizálása fontos, de nem elégséges megközelítés, mert sem a fehérje-, sem a fehérjeszerkezet funkció közötti összefüggésekről nem mond semmit. A proteomika tehát lényegesen nagyobb technikai kihívást jelent az analitikusok és biokémikusok számára, mint a genomika. Ezt az állítást az előbbiekben említetteken túl azzal lehet – és kell is – még indokolni, hogy a genomika rendelkezik a polimeráz láncreakció (PCR) lehetőségével, amelynek a segítségével a kérdéses DNS-szakasz sokszorozását lehet kialakítani, megalkotva ezzel az adott genomikai feladat megoldásához szükséges DNS mennyiségét. Ugyanez a lehetőség – tehát a vizsgálandó fehérjemolekula mennyiségének a megsokszorozása – a proteomikában nem áll a kutatók rendelkezésére. Egy ismert fehérje szerkezete ugyan ma már lefordítható a nukleinsavak nyelvére, de egyelőre hiába kész az aminosav – dezoxiribonukleotid nagyszótár – és hiába rendelkezünk a megfelelő szintetizáló enzimekkel, ismeretlen szerkezetű fehérje sokszorozása még nem lehetséges. Kémiailag legalábbis. A feladat fizikai módon oldható meg, de a kérdés ennél összetettebb. A fizikai megoldás pedig a minta-előkészítés a fehérjeanalitikában, vagy mondjuk inkább a proteomika analitikájában, amibe minden további megjegyzés nélkül a peptidek, és szükség esetén az aminosavak analitikáját is beleértjük. Ha így rendszerezzük a feladatokat, akkor különösen az aminosav-analitika minta-előkészítésében alkalmazunk kémiai módszert, úgymint származékképzést. De mint alább még fogunk említést tenni, a fehérjék analitikájában is „divat lett” a címkézés, vagyis a kémiai jelölés.

Mint már annyiszor említettük, egy analitikai feladat megoldásáért végzett mérést végül is valamilyen spektroszkópiai technikával végezhetünk el. Például az analitikában ez leginkább – de egyre kevésbé – az ultraibolya/látható spektroszkópia vagy – egyre inkább – valamilyen más elektromágneses hullámtartományban működő spektroszkópia, mint például az IR, Raman és/vagy NMR. Ez utóbbi spektroszkópiai technikák persze nem azért lettek alkalmazhatók például a proteomikában (is), mert a fehérjék szerkezete megváltozott a 21. századnak megfelelően, hanem a technikák lettek használhatóbbak. Ez esetünkben azt jelenti, hogy olyan adatértékelés fejlődött ki a műszertechnikával együtt, amely lehetővé tette, hogy a makromolekulákon végzett mérések óriási adathalmaza is feldolgozható és aztán értékelhető lehessen. Ez utóbbi már a proteomika valamilyen könyvtárának is köszönhető. Ez nem azt jelenti, hogy mindig mindent készen kapunk, hiszen akkor nem bővülne az információ, de az alap stabilan kialakult. A proteomikának a legnépszerűbb és legtöbbet tudó vizsgálati eszköze az MS. Annak is különböző „változatai”, általában attól függően, hogy milyen típusú proteomikai feladat megoldásához kell felhasználni. Persze őszintén be kell vallanunk, hogy – különösen az MS típusának a kiválasztásánál – az anyagiak is szerepet játszhatnak. Azonban az MS bármennyire is uralkodik a proteomika analitikájában, bizonyos speciális feladatok megoldására az MS-en és a korábban említetteken kívül is léteznek speciális detektorok. Erről és a detektálás további részleteiről később még lesz szó.

A proteomikai kutatásokat – elsősorban sejtbiológiai szempontokból – aktuálisan három területre oszthatjuk fel, úgymint:

•          funkcionális
•          strukturális és
•          „kifejeződés”-

proteomika. Az ilyen felosztás mindig egy kicsit önkényes lehet. Ez talán most kevésbé az, de tény, hogy az egyes területek – értelemszerűen – most sem teljesen függetlenek egymástól. A funkcionális proteomika olyan vizsgálatok összessége, amikor a fehérje eredeti, tehát nem denaturált állapotában történik a vizsgálat, amelynek tárgya az adott fehérje működésének a tisztázása, illetve megismerése. A strukturális proteomika művelői – értelemszerűen – a vizsgálandó fehérje szerkezetére kíváncsiak. A minta-előkészítésnek azt a célt kell szolgálnia, hogy az adott fehérje végül is kristályosítható legyen.

Az expressios, vagy magyarul inkább kifejeződésproteomikának elkeresztelt terület ma talán a leginkább kutatott és így legizgalmasabb terület. Nemcsak azért, mert a maga teljességében válik vizsgálat tárgyává egy sejt mindenkori fehérjeállománya, és ezzel kiérdemli a „legösszetettebb proteomikai terület” jelzőt, de azért is, mert a vizsgálatok során olyan „nagy halat” is kifoghatunk az adott állapotú sejt összes fehérjéiből, amelynek patológiás jelentősége van. Amikor ez bekövetkezik, akkor tulajdonképpen az orvostudomány területére kerültünk, és a proteomikát máris:

•          klinikai proteomikának

hívják. A klinikai proteomikában azoknak a fehérjéknek a vizsgálatával foglalkoznak, amelyeknek valamilyen klinikai jelentősége van. A cél minden ilyen fehérje esetében a molekula szerkezetének az azonosítása és a patológiás állapotban bekövetkezett estleges szerkezeti és/vagy mennyiségi változása. Egyébként az ilyen fehérjéket – a felfedezésüket követően – „betegségmarkerek”-ként tartjuk számon. A patológia területén funkcióval rendelkező fehérjék azonban nemcsak a diagnózis kialakításának az eszközei lehetnek, hanem – természetesen ennek megfelelően – a gyógyításnak is, amennyiben azt gyógyszeres beavatkozással kívánjuk elérni. A gyógyszerkutatásban tehát a „kifejeződés”-proteomika komoly és mindenképpen fontos szerepet kapott, mintegy katalizálva annak fejlődését. A patológiás állapotban a szervezet szempontjából egyértelműen negatív funkcióval rendelkező fehérje, a felismerése után a megfelelő gyógyszerkutatás céltáblája lesz. Ennek megfelelően a kutatás olyan aktív molekulák irányába folytatódhat, amelyekkel képesek vagyunk egyrészt célba találni, és a kellő hatást kiváltani. Amennyiben a célba jutás pozitív következménnyel jár, miközben a toxikus hatások, azaz az ún. mellékhatások lehetőleg minimálisak maradnak, akkor egy gyógyszermolekula-jelöltet találtunk. Azt a gyógyszerjelölt molekulát, amely a kiválasztott célmolekulára a legjobb hatással van, azt minden esetben az adott téma vezető molekulájának keresztelik el a kutatók. A többi már a kombinatorikus kémia feladata. Visszatérve a proteomika eredetileg említett területeire megállapíthatjuk, hogy azok közül a „kifejeződés” proteomika biológiailag és analitikailag is a legösszetettebb terület, tehát az itt felmerülő problémák analitikájának megoldása követeli meg a legsokoldalúbb minta-előkészítést.

Az a biokémikus/analitikus, aki engedett a proteomika csábításának, és ennek a tudománynak a művelőjévé avanzsált, figyelembe kell, hogy vegye a téma szépsége mellett annak – elsőre – elrettentő jellemzőit is, amelyek az analitikával (is) kapcsolatosak. Okozza pedig ezt az, hogy egy sejt:

•          több százezer különböző anyagot is tartalmaz(hat),
•          az izolálni kívánt molekula mellett ahhoz fizikai-kémiai szempontból nagyon hasonlót is tartalmaz(hat).

Ugyanakkor
•          az izolálni kívánt fehérjemolekula stabilitási problémákkal rendelkezhet,
•          az izolálni kívánt fehérjemolekula mennyisége nagyon kicsi lehet, miközben
•          az izolálni nem kívánt fehérjemolekulák mennyisége ennél akár több nagyságrenddel nagyobb is lehet, és
•          a jelen lévő – és izolálandó – fehérjemolekulák oldhatósága lényegesen különbözhet is egymástól.

Amikor korábban a multidimenzionális kromatográfia rejtelmeivel foglalkoztunk, megállapítottuk, hogy a kromatográfiás technika elvileg kétféleképpen lehet multidimenzionális, az elválasztási és/vagy a detektálási részénél. Az előbbi a több okból történő szelektálást/sorbarendezést állítja elő, és az összetételében sokdimenziós minták kromatográfiás kezelésére lehet alkalmas. Ez az eset akkor „tökéletes”, ha az elválasztó rendszer dimenzionalitása nem kisebb, mint a mintáé. A proteomikai minták esetében a vizsgálat tárgya bizony igencsak sokdimenziós valami, ezért a vizsgálati minta is az, így annak mérendő mintává való feldolgozása általában „rázós” analitikai feladatnak tekinthető.

A multidimenzionális kromatográfia azonban – ahogy azt korábban már, és az előbb is említettük – a detektálás folyamatában is lehet az. Ilyenkor az adatgyűjtés olyan, hogy a retenciós idő függvényében többdimenziós adatokat, vagyis vektorokat kapunk, így működik minden esetben egy MS.  Persze az ilyen jellegű adatgyűjtéshez megfelelő színvonalú számítógépes háttér szükséges. Ilyen multidimenzionális adatgyűjtést ma már nemcsak MS segítségével, hanem – mint azzal korábban már foglalkoztunk – az elektromágneses tér jelentős tartományát felhasználhatjuk (UV/látható, IR, Raman, NMR stb.). De – mint például éppen a proteomikában – kétszeresen is lehet egy kromatográfiás módszer multidimenzionális, ezért egy teljes kromatográfiás módszerben az elválasztási-, és a detektálási folyamatot „egyszerre” jellemezheti a multidimenzionalitás. Ezek a nagy rendszerek on-line vagy off-line módon hatalmas adatmennyiséget szolgáltatnak. A proteomikában a vizsgálat tárgya, és az ezért felvetett kérdés(ek) összetettsége miatt, általában éppen erre van szükség. Miután az analitikai feladatok megoldó eredményeit, az analitikai mérés(ek) értékeitől/adataiból tudjuk (vagy nem tudjuk) létrehozni, ezért minden mást, amit ezek előtt a mérések előtt a vizsgálati mintával elvégzünk, azokat e mérések kivitelezhetőségéért tesszük. Az így kialakított mintát éppen ezért – mint már annyiszor hangsúlyoztuk – mérhető mintának kereszteltük el. Egy kromatográfiás módszer elválasztó lépését/lépéseit így tehát talán nem ok nélkül sorolhatjuk a minta-előkészítés lehetőségei közé még akkor is, ha leginkább „csak” didaktikai jellegű ez a besorolás, mert a feladatok technikáját igazából nem befolyásolja. Ez leginkább szemléleti kérdés. A proteomika analitikája azonban ezt a besorolást szépen példázza, ezért hangsúlyoztuk azt ismételten.

A proteomika analitikájának a sémája (44.1 ábra) alapvetően tehát első közelítésben nem különbözik az általános analitikai sémától. De tényleg csak első közelítésben. Azt is mondhatjuk, hogy minden analitikai fázis megvan a proteomikában is, csak ahogy oda eljutunk, az sokkal nagyobb feladat, mint egy „közönséges” analitikai feladat esetében. Persze ez a közönséges jelző kicsit sutának érződik. Szóval a proteomika analitikája a minták sajátos összetettsége miatt igencsak „rázós” tud lenni. És akkor még finoman fogalmaztunk. Hogy miért, azt az előbb már felsoroltuk.

De ha eltekintünk minden más anyag jelenlététől, és csak a fehérjekomponensekkel kapcsolatos problémákat tekintjük, akkor is van mit figyelembe venni, amint azt a 44.1 táblázatban összefoglaltuk. Persze a valós napi gyakorlatban ez nem lehetséges, illetve azt is megfelelően meg kell oldani, hogy egy proteomikai mintában nem csak fehérjék vannak. Részben, mert a vizsgálati mintában eredendően benne van, másrészt a vizsgálati mintába bele kell tenni, merthogy a proteomikában mintát kell feldolgozni. (lásd később!)

 

44.1 táblázat

 

44.1 ábra

 A 44.1 ábra tehát – mint mondtuk – „csak” jelképeiben hasonlít a korábban közölt általános analitikai sémákra. Igen, ezek mögött a sémák mögött minden más hasonlónál összetettebb vizsgálati anyagok, vizsgálati minták találhatók a proteomikában. Ebből következően mind a szükséges minta-előkészítés, mind pedig a következtetések levonása a mérési eredményekből, vagyis a feladat végeredményének a kialakítása, összetettebb, mint „általában” az analitikában. Persze azt nem állítjuk, hogy egyes környezeti minták analitikájában bizonyos súlyos esetekben nincs megközelítően hasonló nehézségi szint, de az általában a vizsgált komponensek toxikussága miatt az.

A 44.2 ábrán egy proteomikai vizsgálat lépéseit tüntettük fel. Az ábrának a következő címet adhatnánk: „A vizsgálati anyagtól a mérhető mintáig”. A minta-előkészítést hangsúlyozva. Az egyes lépések magyarázatát a szövegben adjuk meg. Itt szükséges hangsúlyozni, hogy az analitikában, de a proteomikában különösen, nincs két egyforma minta (csak ha ismétlést végzünk!), és ezért szinte minden minta analitikai protokollja valamennyire különbözik egymástól, természetesen a minta-előkészítésé is. A 44.2 ábrán vázolt többlépéses folyamattal végül olyan, ún. „mérhető minta” készül el, amely alávethető a kívánt analitikai mérésnek, azaz a detektálásnak. A 2-D gélelektroforézis esetében az elválasztás után foltokban fog megjelenni a vizsgálati minta, mely az előhívással lesz látható. A gélelektroforézis lemez analízise, azaz egy képanalízis után a tovább vizsgálandó foltot, foltokat a kutatók további minta-előkészítésnek vetik alá. Ez lehet leoldás, enzimes hidrolízis és további szeparálás valamilyen HPLC technikával, aztán MS mérés/detektálás (LC-MS/MS), vagy már „csak” MS mérés (MALDI-TOF). Mindezt a 44.3 ábrán vázoltuk.

A proteomika analitikájának az elmondottak alapján a következő speciális lépései vannak:

1.         A vizsgálat tárgyának a kiválasztása.
2.         A vizsgálati minta vételezése.
3.         A mérendő komponensek oldhatóságának kialakítása.
4.         Az oldhatatlan sejtkomponensek eltávolítása.
5.         Az aggregátumok és hidrofób kapcsolatok megakadályozása a minta komponensei között.
6.         A vizsgálati minta tisztítása(1), azaz azoknak a – mátrix – komponenseknek az eltávolítása, amelyek interferálnak a vizsgálandó fehérjével, fehérjékkel.
7.         A vizsgálati minta tisztítása(2), azaz azoknak az anyagoknak az eltávolítása, amelyek, jelenlétükkel zavarják a mérendő komponensek szeparálását.
8.         A vizsgálati minta tisztítása(3), azaz azoknak az anyagoknak az eltávolítása, amelyek jelenlétükkel zavarják a mérendő komponensek ionizálását (API).
9.         A mátrix segédanyag hozzáadása a vizsgálati mintához az ionizálás érdekében (MALDI)

A felsorolásban foglaltak némelyike – mint amilyen az 1 - 4 pont – általában megemlíthető az analitika egész területén. A proteomika azonban valahogy kritikusabb. Mert például a vizsgálat tárgyát minden analitikai feladat megoldásához ki kell választani, mégpedig kellő odafigyeléssel, de a proteomikában még inkább nem mindegy, hogy mit vizsgálunk. Az oldhatóság is kulcskérdés az analitika legnagyobb részében, ha itt nem is mindig, a kromatográfiában azonban igen. A membrán fehérjék oldatba vitele azonban nem egyszerűen egy határozott összerázás kérdése.

44.2 ábra

44.3 ábra

Feltétlenül meg kell említeni, hogy a fehérje analitikája, a proteomikának nevezett –  és elsősorban humán – területen kívül természetesen nemcsak a szintetikus szerves vegyi laborokban létezik. Nincs igazán nagyon messze a proteomikától az ún. rekombináns fehérjék biológiai szintézisének a területe. Szintén fehérjék, elsősorban enzimek termelődése, mikrobiális termeltetése során kell analízist végezni. A biotechnológia ezen területe annak talán a legnagyobb részét teszi ki. A legnagyobb különbség a proteomika és a biotechnológia fehérjeanalitikája között a lépték. A biotechnológia fehérjeelválasztásai, a termelés az enzimtermelés során egyértelműen preparatív méretű. A fejlesztések, kutatások során azonban ez – értelemszerűen – még nincs így. Mert ebben a periódusban ez is analitika. Miközben a fehérje a biotechnológiában is fehérje. A vizsgálati anyag pedig mintavételezéssel analitikai mintává redukálódhat mennyiségileg, vagy a maga teljességében kerül preparatív léptékű feldolgozásra. De a minta-előkészítés mindkét esetben tartalmazhat különbséget a proteomikához képest. A rekombináns biológiai technikával termelt fehérje elhelyezkedését tekintve kétféle lehet, úgymint:

•          intracelluláris, vagyis a termelő sejten belüli, és
•          extracelluláris, vagyis a termelő sejten kívüli.

Ennek a két termeltetési típusnak a vizsgálati mintáját másképpen kell feldolgozni, amennyiben az utóbbi esetben a termelő sejtektől „csak” meg kell szabadulni a minta-előkészítés első lépéseként. Az intracelluláris típusú termeltetés esetében, a proteomikához hasonlóan, ez az első lépés a sejt lízise. A továbbiakban már mindkét biotechnológiai termeltetés esetében azonos az eltérés a proteomikától.

A rekombináns fehérje célirányos biotechnológiai termeltetése nem rendelkezik – a biotechnológusok legnagyobb örömére – a „kifejeződés”-proteomika mintáinak az életszerű összetettségével. Ez persze nem jelenti azt, hogy egy ilyen minta maga az unalmas egyszerűség. Egyáltalán nem. Aki résztvett már egy antibiotikumot tartalmazó anyag feldolgozásában, az sohasem fogja ezt gondolni. Pedig az antibiotikumok nem is enzimek! Törékenyek és instabilok. Bár a penicillinek sem akármik. Mégis egy sejtlizátum, az igen, az valami, az analitikus nézőpontjából (is).

Miután fentebb a lépték fogalmát használtuk, amikor a biotechnológiai termelés preparatív feldolgozását a proteomika vizsgálatával vetettük össze, utólag be kell vallanunk, hogy a proteomika abban is különbözik az analitika egyébb területeitől, hogy sok esetben a vizsgálati anyag, és ebből következően a vizsgálati minta mennyisége igencsak korlátozott. Talán csak a kriminológia analitikájában lehet kevesebb.

Ez azután nem csak azzal jár, hogy mindennél gondosabban kell kezelni a mintát, de azzal is, hogy a pancsolási veszteségek elkerüléséért az eszközök méretét is lecsökkentették. Az elmúlt alkalommal a szilárd-fázisú extrakcióról mint a minta-előkésztés egyik hasznos eszközéről volt szó. Most kell kiegészítésként arról beszélni, hogy a proteomikában is használják ezt a technikát a különböző mintatisztításokhoz, de azt – a kis mintamennyiségek miatt – nem töltött SPE patronban vagy cartridge-ban végzik, hanem töltött mikropipettahegyben, amelyeknek egyik legnagyobb felhasználója a proteomika. Ennek megfelelően alakult ki a különböző módon töltött mikropipettahegy piaci kínálata is.

(Folytatjuk)
Pásztor József