Bemutatkozás/Labinformálódás/Kromatográfia sorozat 48. rész



Mintaelőkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC), 48. rész: A „kromatografológia”, avagy a kromatogram olvasásának művészete.

„Csodálkozol a kokainistán
s nem érted?
Gondolkozzál az okain is tán –
s megérted!”
(Kosztolányi Dezső)

Az írás, ami a dolog természeténél fogva – mint például az adó – csak emberi lehet, egy másik embernek csak akkor jelent valamit, ha nem analfabéta. Kellő szövegértéssel az írás megfelelően értékelhető. Íráselemzőnek, tudományos néven grafológusnak azonban egy írás többet jelent az adott írás betűsoránál, „puszta” szövegénél. Sőt egy grafológust kifejezetten az írás/szöveg egységeinek, a szavaknak és az írás/beszéd legkisebb önálló egységének a betűknek az alakja, valamint az adott szöveg (kül)alakja érdekli, és nem a szövege.

Bár a kromatogram és az írás elemzése közötti analógia felvetése sem mentes azoktól az életünk különböző területeinek összevetését jellemző sántítástól, e sorok írója úgy gondolja, hogy az általa fentebb említett analógia sem erőltetettebb, mint más hasonló összevetés. Már csak az elnevezés okán sem, sőt. Csupán az összevetést kell úgymond finomítani. Remélhetőleg a kedves olvasó (is) kétségek nélkül fogadja el az említett analógia talán legjellemzőbb érvelését, amelyet e sorok írója most minden hétköznapi demagógia nélkül szeretne használni. Ezek szerint „minden mögött van valami”. Jelezve ezzel, hogy az írás és a kromatogram kialakulása is okkal történik. Remélhetően az olvasók ennél a pontnál nem riadnak meg, és elfogadják a téma materialista kezelését. Már csak a szerző ez irányú lelkesedése érdekében is.

A grafológia, alias íráselemzés, lehetőséget teremt arra, hogy ismeretében egy adott írásnak ne csak a puszta szövegét, de a betűk írójának fájdalmát, örömét, érzelmeit, vágyait, vagyis lelkének legbelsőbb rejtelmeit megismerhessük. Tekintettel arra, hogy a kromatográfia is a gyakorlatban valamiféle, de mindenképen eléggé speciális „írást” állít elő (ettől gráfia!), a kromatogramot. Felmerül a kérdés: vajon ebből a „szövegen” túl mi olvasható ki?
Persze nyilván minden kedves olvasó előtt világos, hogy míg a kézírás eredendően pusztán valamilyen szöveg közlésére (levél) és/vagy rögzítésére (napló) szolgál. Ugyanakkor egy kromatogram egy analitikai folyamat eredményének a rögzítése, tehát nem egyszerűen olvasásra, de eleve további értékelés részére készül az analitikai feladat megoldásához.

Az alábbiakban a kromatogram elemzésével – a grafológia analógiájával – szeretnénk érzékeltetni, készítőjének, vagyis a folyadékkromatográfnak mint műszernek (HPLC) és a körülményeknek mint módszernek a legbelsőbb titkait. Végül – túllépve a grafológiai analógiákon – a kromatogramból levonható analitikai következtetésekről is kívánunk szólni.

Kezdjük az elmélkedésünket egy olyan összevetéssel, amely lényeges különbséget mutat a grafológiai és a kromatogramelemzés között már kiindulásában is. Ezek szerint – összefoglalóan – egy ronda írás háttere is lehet jó, de egy ronda kromatogram mindig rossz technikai (készülék) és/vagy elméleti (módszer) hátteret sejtet, vagy egész egyszerűen jelent. Eltekintve a preparatív kromatográfia „lórúgásszerű” injektálásától keletkező rettenetes kromatogramtól, mely jóságában is ronda. Csak a teljesség kedvéért tesszük hozzá, hogy egy esztétikailag szép írás is lehet problémás. Ez utóbbi állítás persze időnként egy kromatogramra is lehet igaz.

Lényeges, mondhatni szintén alapvető különbség ezenkívül még az is a fenti két fogalom között, hogy míg a grafológia eredménye majdnem kizárólag minőségi, addig a „kromatogram eredménye” a feladatok többségében – tehát még véletlenül sem kizárólag – mennyiségi. Persze a multidimenzionális kromatográfiában, ahol már nem is kromatogram az elválasztástechnikai vizsgálat végeredménye, csak az első dimenzióban, hanem a különböző spektrális detektorokból spektrumok keletkeznek, a retenciós idők függvényében.

Persze az előbbi megjegyzésekkel csak a két legkirívóbb különbséget kívántuk érzékeltetni. A többire folyamatosan teszünk utalást, bár reméljük, hogy a kromatogram-elemzés ismertetése során ezek további hangsúlyozás nélkül is nyilvánvalók lesznek az olvasók számára (is). Egyébként jelen cikkünk témáját végül is a kromatogram-elemzés rejtelmeinek az ismertetése szolgálja. Hogy az alcímben szereplő analógia az íráselemzéssel mennyire szoros, az nem csak az esztétikai érzékünk számára lehet fontos mint szépírói teljesítmény, a kromatogram értékelésének rejtelmeit valójában nem befolyásolja.

A kromatogram
A kromatográfiás folyamat, tehát az elválasztások során illetve után, az oszlopról a retenciós idő függvényében kilépő, és a detektorba egyúttal belépő mozgófázis összetételét jellemző írás, a különböző mintakomponensek mennyiségének a függvénye. Tulajdonképpen annyi y = f(t) függvény egymásutánisága, ahány komponenst a mintánk tartalmaz, illetve amennyit ebből az alkalmazott rendszerünk elválasztani, detektorunk pedig észrevenni képes. A detektor az illető komponens valamilyen tulajdonságát méri, és a mért értékkel arányos jelet ad. A detektorok egyik jellemzője éppen annak a tartománynak a nagysága (szélessége), amelyben ez az arányosság változatlan, vagyis a detektor mérési tartománya lineárisnak tekinthető.

Itt szükséges megemlíteni azt a sorozatunk korábbi részében már szereplő tényt, miszerint az UV-VIS detektor manapság is létező népszerűsége éppen abból ered, hogy az előbb említett lineáris mérési tartománya a létező detektorok között a legnagyobb. Több nagyságrendű koncentráción át is tart. A linearitás – amely sajnos éppen a leguniverzálisabb és egyik legérzékenyebb detektor – az MS-detektornak a gyenge pontja. Visszatérve a kromatogram definíciójához, az a detektorból kijövő jel időbeli változásának a rögzítése, rajza. Ami valamikor, mondjuk a 70-es években azért sikeredett rondára, mert a „kromatográfiás rajzgép”, más néven a kompenzográf igencsak silány volt, elsősorban a tolla miatt. A kromatogramban megjelenő eluálódott anyagok csúcsainak területe (a jel idő szerinti integrálja) arányos a komponens mennyiségével. Egy kromatogram egyébként a minta elválasztott komponenseinek – de csak az elválasztottaknak – mennyiségi és minőségi adatait tartalmazza. Közvetetten, mert a kromatográfia nem abszolút módszer. Vagyis a kvantitatív eredmények levonásához megfelelő standard szükséges. Persze az a kvalitatív vizsgálatokhoz, azonosításokhoz sem árt. A mennyiségi vizsgálatok esetén a standard alkalmazása a kalibráció. A csúcs alatti területek összevetéseiből lehet a mennyiségi következtetéseket levonni. Abszolút mennyiségi következtetéseket standard vegyület(ek) segítségével, valamilyen kalibrációs módszeren keresztül, relatívakat – hasonló szerkezetű komponensek/anyagok esetén – standard vegyület(ek) alkalmazása nélkül is levonhatunk. Ilyenkor a minta komponenseinek százalékos arányát kaphatjuk meg. Ez persze nem ad teljesen pontos eredményt.

A kapott eredmény annál jobban megfelel a valóságnak, minél kevésbé tér el az alkalmazott detektor érzékenysége a minta komponenseire. Ez az igény leginkább hasonló, illetve homológ vegyületekre teljesül. Lényegesnek tartjuk megjegyezni, hogy a felbontatlan csúcsok értékeléséhez különböző igényű és képességű matematikai módszerek léteznek.

Egy kromatogram minőségi információi a felbontott csúcsok retenciós értékeiben vannak. Amennyiben az két különböző rendszerben is azonos, mint az ugyanabban a rendszerekben futtatott standardé, akkor a két vegyület azonosságának a valószínűsége közel van a 100%-hoz. Amennyiben növeljük az azonosításra felhasznált rendszerek számát, és az említett retenciós idők azonossága változatlanul megmarad, akkor az azonosság valószínűsége persze tovább nő. Ez az – jócskán eszköz- és munkaigényes – azonosító technika azonban manapság – az MS-detektorok megjelenésével – igencsak érdektelenné vált.

Ezért ez a – nem igazán barátságos – módszer inkább csak a „szegény ember vízzel főz” tipikus esetét jelenti. A minőségi meghatározás ma már a multidimenzionális kromatográfiás technikák feladata. Persze ha van ilyen készülékünk, úgymint HPLC-DAD, és/vagy HPLC-MS, és/vagy HPLC-MS/MS, és/vagy HPLC-NMR, és/vagy HPLC-FTIR, valamint HPLC-ICP/MS. De ezek a készülékek már nem kromatogramot, hanem a retenciós idő függvényében különböző spektrumokat szolgáltatnak, ahogy azt a detektorában multidimenzionális kromatográfiától el is várjuk, hiszen ezért alkalmazzuk. Egy kromatográfiás módszer azonban a többszörös – és különböző! – elválasztások alkalmazásával is multidimenzionálissá tehető. Az előző esetben a szerkezet felderítése/azonosítása a cél, az utóbbiban pedig a rendszer szelektivitását kell többdimenzióssá tenni. A multidimenzionális elválasztás természetesen a detektálás során kromatogramot, mégpedig elválasztásonként egy kromatogramot produkál. Együttes értékelésük nem is olyan nagyon egyszerű feladat.

Egy kromatogramról az előbbiekben csupán mint egy kromatográfiás mérés eredményeit magában foglaló írásról beszéltünk. Ez analóg a kézírás betűsorrendjével, azaz szövegével. Egy kromatogramban azonban ugyanúgy több van a mérési eredményeknél, mint a kézírás betűsorrendjében, vagyis szövegében. Azzal – a már említett – különbséggel, hogy a kromatogram úgymond rondasága már eleve rossz ómen a HPLC-s készülékünk aktuális állapotára, működésére, és/vagy az alkalmazott módszerre, analógiában azzal, amit egy kézírásból olvashatunk ki annak írójáról.

Mint azzal sorozatunk egy korábbi részében már foglalkoztunk, egy kromatogram a gyártójának minden egyes komponenséről hordoz, hordozhat információkat. A gyártó pedig mindig az adott kromatográf, a maga teljességében, az injektortól az oszlopon át a detektorig vagy detektorokig.

A kromatográfiás készülék és a kialakult kromatogram
A továbbiakban a kromatogram milyenségét, előállítójának, vagyis a kromatográf egységeinek működési állapota, valamint a kidolgozott módszer minőségének szempontjából fogjuk tárgyalni. Ennek során – mint sorozatunkban eddig szinte mindig – kizárólag a folyadékkromatográf a tárgyalandó téma, most éppen alapvető terméke, a (folyadék)kromatogrammal – mint analitikai írással – kapcsolatban.

Az injektor
Az injektor minden zárt, tehát nem kiterített állófázisú elválasztástechnikai készüléknek az „eleje”. Az injektálás pedig minden kromatográfiás módszer első, mondhatni szinte szó szerint bevezető lépése, akármilyen konfigurációjú is az adott rendszer. Ezért, ha működése nem megfelelő, akkor a probléma (hiba) egészen a kromatogramig terjed. Az injektor működési problémái talán a legkevésbé észrevehetőek a kialakult kromatogramon, kromatogramban. Ezért talán a legjobban példázza egy analitikusnak, jelen esetben egy kromatográfusnak legfontosabb erényét, az örök kételkedést az analitikai – jelen esetben folyadékkromatográfiás – eredmények helyességében. Aminek most jelen témánk okán, a kromatogramban való elsődleges, úgymond „bizalmatlanság”-ban kell kifejeződnie mind kvalitatív, mind pedig kvantitatív szempontból. Ennek azonban csak kizárólag elsődlegesen szabad léteznie, amennyiben az analitikus/kromatográfus másik nem kevésbé fontos erénye az a szakmai hozzáértés, amivel annak a bizonyos elsődleges kételkedésnek az igazát, vagy elvetését másodlagosan bizonyítani tudja majd, mindenekelőtt az adott feladatról meglévő, előzetes információk figyelembevételével.

Az injektor működése és a kromatogram megjelenése közötti kapcsolat egyébként – többek között – arra is példa, hogy egy viszonylag szép kromatogram is lehet hibás vagy inkább talán „hamis”, amennyiben egy úgynevezett „szellemcsúcs” is lehet úgymond formás.

Fejtegetésünket most a kézírás és kromatográfiás írás közötti analógia egy további „gyengítésével” szakítjuk meg.
A kézírás esetében nem szokás az írást újra elkészíttetni az írójával. Egy hosszabb írásban éppen eleget ismétlődnek a jellemző bélyegek ahhoz, hogy az írás értékelhető legyen. Egyébként két írás között a jellemző bélyegek ismétlődése egy íráson belül, egyértelműen problémaerősítő hatású. Tehát egy íráson, kromatogramon belül is (lásd később!). De amennyiben a kézírást általában nem szokás megismételni, addig egy kromatogram ismételt előállítása az analitikában nem egyszerűen lehetséges, sőt inkább kívánatos, ami például az ún. validálás során kötelező is!

Visszatérve az injektor működése és a kromatogram kapcsolatának tárgyalásához. Ha a dolog talán nem annyira durva, hogy a kételkedésünket akár minden, különösen az ún. major, tehát nagy csúcsokra is kiterjesszük, de bizony a kicsi, azaz ún. minor csúcsok esetén felmerül, hogy az (vagy azok) valóban a mintából származnak-e, vagy csak a készülék szennyezései valahonnan a múltjából. Egy kromatográfiás csúcs valódiságának, vagyis az adott mintához tartozásának egyik a kromatográf injektorát is érintő bizonyítéka, megjelenésének a reprodukálhatósága. Azért egyik, mert egy szellemcsúcs, vagyis az okozó szennyezés nemcsak az injektorból származhat, de az oldatkészítés során is bekerülhet a vizsgálati mintába, és akkor még reprodukálható is. Ezért a teljes bizonyíték egy csúcs „szellemiségére” megköveteli egy második vizsgálati minta vizsgálatát is, amennyiben a kérdéses csúcs vagy csúcsok, az eredeti mintával reprodukálhatók.

Egy kromatográfiás sorozatmérést a fentiek okán általában legalább két olyan injektálással „illik” kezdeni, amely nem okoz mintabevitelt a rendszerbe. Az első ilyen injektálás semmit se tartalmazzon, az injektálás során csak a mozgófázis „fusson” magában át a rendszeren. A másik injektálás a minta oldószerét tartalmazza kizárólag minta nélkül. Ezt hívják egyébként blank injektálásnak. Ezekkel a vizsgálatokkal legalább a mintaelválasztás hátterét, persze mindenképpen a detektálás hátterét, valamint az oldószer jelét kereshetjük. A folyadékkromatográfiában (HPLC, TLC) egyébként igyekezni kell a mozgófázist használni a minta oldószerének. Sajnos elég gyakran – oldhatósági okokból – ez nem lehetséges. Igyekezni kell azonban az eluenstől nem nagyon különböző oldószer-összetételt használni ilyenkor is. Sajnos ez a probléma mindenképpen csúcsalaktorzulást okozhat. Talán a hőmérséklet az a metodikai változó, amelynek emelésével a mozgófázis oldóképességét növelhetjük, amennyiben a mintakomponensek egyike sem hőérzékeny. Egy kromatográfiás injektor tisztaságát egyébként a mintainjektálások olyan megszakításával próbálhatjuk meg biztosítani, amikor ismét csak kizárólag a minta oldószerét, vagy egy annál még erősebb oldószert/oldószerelegyet injektálunk a rendszerbe.

Egy injektor azonban nemcsak szennyezett lehet, de szivároghat, és el is tömődhet. Az első esetben a kapott kromatogram csúcsai igencsak törpék lesznek, és azok se lesznek reprodukálhatók. A második esetben nem kapunk detektorjeleket, vagyis csúcsokat tartalmazó kromatogramot. De mitől is kapnánk? Persze ez utóbbit más egység, például a pumpa hibája is okozhatja, amikor „egyszerűen” nincs áramlás a rendszerünkben, ez a detektorcella kimenetén elég könnyen észrevehető, ellenőrizhető.

Sajnos sokszor az injektor problémája odáig fajulhat, hogy kémiai módon nem is hozható rendbe, legalábbis „működés közben” nem. Ilyenkor nyilván az injektort szét kell szedni. Őszintén be kell vallani, hogy a manuális, vagyis a kézi injektor egyetlen előnye a szétszedhetőségében van, amennyiben szétszedett állapotban kémiai tisztítása, és/vagy alkatrészeinek cseréje nem túl nagy megpróbáltatás a kromatográfus számára (sem). Csak legyen megfelelő alkatrész hozzá.

Egyébként tanácsként elmondható, hogy automata injektor használata esetén is legyen valamelyik laborfiókunkban egy lehetőleg jól működő kézi injektor. Bármennyire is demagóg az állítás, de aki látott már ördögöt fáradtan, az tudja, hogy az azért ilyen, mert sohasem alszik.

A pumpa
A pumpa működésének lényege – értelemszerűen – a mozgófázis áramlásának a létrehozása. Ezt azonban nemcsak sebességében, de összetételében is a pumpa végzi. Ez működhet egy központi szabályozó egység irányításával, vagyis ún. „remote control” módban, vagy a pumpa, nevezetesen az ún. Master pump maga irányítja önmagát, izokratikus rendszert teremtve ezzel, vagy a társait (Slieve pumps) is, akkor viszont gradiens rendszerként. Az egy időben változó összetételű oldószerelegy szállítására is képes pumparendszer egyébként kétféle konfigurációval, ennek megfelelő megoldásban létezik.

Az egy pumpával működő oldószerszállító egység esetében az oldószer-összetétel a pumpa szívóoldalára installált, általában négyes szeleprendszer időbeli programozásával alakítható ki. Ezért ezt a megoldást kisnyomású-, vagy szívó oldali gradiensnek nevezték el. Legnagyobb előnye a másik megoldással szemben kizárólag az alacsonyabb ár. A szívó oldali keverés okán, egy többcsatornás gáztalanító alkalmazása tulajdonképpen kötelező. Meghibásodni a pumpa, a szelep, és a gáztalanító képes, de bármelyik meghibásodásának esetében az adott kromatográf nem tud működni.

A mozgófázis összetételének az időbeli változtatásának a másik megvalósítása a nagynyomású oldalon történik, ezért ez a megoldás – a maga természetességében – a nagynyomású-, vagy nyomó oldali gradiens elnevezést kapta. Ez a drágább, de mindenképpen flexibilisebb megoldás. Drágább, mégpedig sokkal drágább, mint a másik, vagyis az egypumpás megoldás. Az utóbbi ugyanis annyi pumpából áll, ahány oldószerből a gradiensünket kikeverni kívánjuk. Ez leggyakrabban – de egyáltalán nem kizárólag – kettő szokott lenni, ami egy binary (binér) gradiens rendszer. Ennél nyilván csak több oldószerből kikevert létezik, de azért használni majdnem kizárólag három oldószeres, vagyis ternary (terner) gradiens rendszert használnak, legalábbis valamilyen HPLC módszerhez. Egyre kevésbé reprodukálható a több oldószeres gradiens, és a kialakítása/programozása se igazán egyszerű. Ennek ellenére a folyadékkromatográfia története számon tart négyes, azaz quaternary (kvaterner) gradiens rendszerű készüléket is. E sorok írójának laborgyakorlatában a múlt század nyolcvanas éveiben egy HP 1090M készülék használata jelentette az igazi élményt és a komoly tanulás lehetőségét.

Ez a nagyszerű, felejthetetlen készülék ugyan „csak” egy hármas (ternary) pumparendszerrel rendelkezett, de ez a rendszer tulajdonképpen négy pumpából állt. Ezt egészítette ki még egy DAD, azaz diódasoros detektor, és a Pascal Workstation, vagyis egy nem Windows alapú munkaállomás (irányító és adatkezelő rendszer). Visszatérve a „megszólított” és néven nevezett HPLC-készülék említett pumpájához, amely három, egyébként dugattyús pumpából állt (ternary rendszer). Ennek a három pumpának az éppen működtetett egységei azonban nem közvetlenül valamilyen keverőcellába szállítottak, hanem a minél hatásosabb simítás, azaz pulzáláscsillapítás okából egy ún. membránpumpába. A nagyszerű működésen túl ennek a pumpaegységnek a pumpák számában volt az egyik legnagyobb gyakorlati haszna. Ugyanis bármennyire is nagyszerűek voltak azok a dugattyús pumpák, a három Rheodyne szelep valamelyike elég gyakran „szállt el”. Az, hogy a három szelep ezt egyszerre tegye meg, emlékezetem szerint sohasem következett be. Ezért tulajdonképpen mindig volt legalább két jól működő pumpa a háromból. A HP 1090M készülékkel kapcsolatos nosztalgiát azonban nem szabad nem kiegészíteni az USA-ból származó készülékek beszerzését kísérő kálváriával, már ami a múlt század 70-es 80-as éveit illette egy szocialista országban. Ennek a kálváriának az okozóját COCOM-listának nevezték, és létezése a világ durva kétpólusosságát jelentette.

Maradjunk azonban egy kromatográfiás pumpa működésénél. Erre általában jellemző, hogy a lehetőség hármas: miszerint vagy működik, vagy nem, vagy – és ez a legveszélyesebb – rosszul működik. Ez a megállapítás első olvasatra talán túlságosan triviálisnak tűnhet. Ha mélyebben belegondolunk azonban a dolgokba és a három lehetőség következményeibe a kromatogram kialakításában, akkor a fentiek alapján már jobban megérthetjük ezt az eredetileg meglepőnek talált felosztást, amely egyébként szinte minden berendezés működését jellemzi. Persze mindegyiket másképpen. Egy HPLC-s pumpa esetében például legveszélyesebbnek ítélt állapot a rossz működés, két dologban jelentkezhet alapvetően. Egyrészt az áramlási sebesség térhet el a deklarált, illetve beállított/beprogramozott értéktől, másrészt az oldószerelegy összetétele tér el a deklarált, illetve beállított/beprogramozott értéktől. Persze a kettő egyszerre is bekövetkezhet. Az első esetben a szindróma a motor, vagy a programozó egység hibájára vezethető vissza, amennyiben sem csepegést nem tapasztalunk az ún. pumpafejből, sem pedig törést a pumpafejben. Azonban, különösen a szívó-oldali keveréssel működő gradiens pumpák esetében, lehetséges – elsősorban a gáztalanító nem megfelelő működése miatt – a pumpafej belevegősödése. Furcsa szakmai szó, de az analitikusok mentségére legyen mondva, a pulmonológiában is használják. Akárhogy is nevezzük a jelenséget, egy buborékokkal tele pumpafej folyadékot szállítani nem tud, csak levegőt. Ha ezt idejében nem vesszük észre, akkor a rendszer oszlopa is levegővel lesz tele. Ezen, valamint a pumpa üresjáratain, a kromatográfiás műszertechnika úgy segít, hogy a kezelőtől, a pumpa megfelelő működésének a „legegyszerűbb” kordában tartásához alsó és felső nyomásértékeket kér. Mind a kettőnek van gyakorlati oka: az alsó nyomásérték nullától eltérő értékre való beállítása például éppen az előbbi pumpaprobléma, a belevegősödés jelzésére és említett következményének kivédésére szolgál. Amikor nincs folyadékszállítás a pumpában, akkor nyomásesés sincs, tehát a pumpa automatikusan leáll. Azonban ha a pumpa leáll, kromatogram se keletkezik a szó igazi értelmében, illetve csak addig, amíg a pumpa még valamennyire működött. Egyébként amennyiben a pumpa „csak” a kelleténél kevesebb oldószert szállít, az a kromatogramon a retenciós idők általános növekedését fogja okozni.

Ha a hiba az oldószerelegy, vagyis a mozgófázis összetételében lesz, akkor ennek a következményei attól függenek, hogy konkrétan mi is történt és mennyire. Ha például egy fordítottfázisú módszer esetében, a mozgófázis víztartalma csökken valami miatt, akkor az erősebb lesz, és a retenciós értékek csökkennek, ezzel pedig a rendszer szelektivitása is. Ha a vizesfázis ionpárképzőt is tartalmaz, akkor ez a nagyobb szerves tartalomra tekintettel elképzelhető, hogy kicsapódik. Ez pedig a nyomásesés valamiféle drasztikus növekedését okozza. A kromatogram egyébként egyre inkább kezd egy őrült kézírására hasonlítani. De azért azt el kell mondani, hogy a pumpa és a kromatogram „kapcsolata” mégcsak követhető valahogy. Egyébként egy pumpa hiba/probléma például a pumpa, vagy még inkább az egyik leállása olyan következménnyel is járhat, amiről sohasem szabad megfeledkezni, akár keletkezik selejt kromatogram, akár nem.

Teljes pumpaleállásnál például nem. De ha előzőleg injektálás történt, akkor a mintának valahol lennie kell, ahogy puffert tartalmazó mozgófázisnak is. A minta általában az oszlopon szokott maradni. A puffer az eluensből viszont a pumpában, az oszlopban, a detektorcellában is található, ahonnan valahogy az egyik vagy másik működő pumpával ki/le kell mosni.

A pumpa működése kapcsán külön fogunk szólni az időben változó mozgófázis, a gradiens időbeli helyességének a vizsgálatáról.

A nyomásérték felső korlátozását a működő kromatográfiás rendszer épségben maradása indokolja. Ez bizonyos érték kialakulása felett igencsak veszélyeztetve van. A töltet, alias állófázis szemcséinek további aprózódása és/vagy a különböző tömítések szivárgása lehet a következmény.

Oszlop
Némi analitikusi iróniával azt mondhatjuk, hogy egy kromatográfiás folyamat gyakorlatilag mindig az injektorban kezdődik, mindig az oszlopban teljesedik ki, és végül a detektorban válik analitikává. Nos, hogy ez a kiteljesedés hogyan történik, és ezek a történések mit okoznak, azt a detektálás közreműködésével, a kromatogram milyenségével tehetjük ismertté, vagy mondjuk inkább nyilvánossá. Ami – amennyiben a kromatográfiás oszlopot a repülőgép fekete dobozával aposztrofáljuk – nem olyan rossz analógia. Egy kromatogram egyébként tekinthető az oszlopon belül történtek naplójának a kromatografálás során, aminek a lejegyzésére valamilyen detektor lett az adott kromatográfus, vagy korábban egy analitikus által kijelölve. Tulajdonképpen ezt a kijelölést nevezik az analitikusok a kromatográfiás módszerkidolgozás egyik lépésének. Hogy ilyen naplóban mi miért van úgy, ahogy, az a kromatografológia egyik legfontosabb területe. Ebben a naplóban benne van az adott kromatográfiás mérés kvantitatív értékelésének a lehetősége. Még egy egydimenziós detektor használata esetén is. Persze nem önmagában, hanem összehasonlítva valamilyen ismert dologgal, valami etalonszerűvel, ahogy tulajdonképpen minden mérés esetében tesszük, ha nem is hangsúlyozzuk állandóan. Ez az értékelés tulajdonképpen az analitikai kromatográfia lényege, mint ahogy ezt már korábban többször is hangoztattuk az analitikai kromatográfia esetében, a preparatívval szemben.

De egy kromatográfiás naplóban benne van a kromatográf aktuális működésének és persze állapotának a kórképe. Leginkább az oszlopénak. Ebből van, ami könnyen felismerhető, és van, ami nehezebben, van, ami pedig csak megfelelő detektor segítségével, és a szelektivitás szempontjából fontos események mindenekelőtt ott játszódnak le. Alapesetben csak ott. „Speciális” esetben igény lehet arra, hogy detektor is legyen. Például, amennyiben a királis anyagokat csak akirális körülmények között tudjuk kromatografálni, akkor szelektivitást nem várhatunk az említett rendszertől, hacsak a detektor nem érzékeny a beérkező anyagok optikai forgatóképességére, és ezért szelektíven működtethető.

Egyébként egy folyadékkromatográfiás oszlop talán első jajszavának megfelelő információ a kromatogramban nem található. Talán csak a készülék saját külön működési jegyzőkönyvében jelenik meg, ha egyáltalán van neki ilyen. De manapság már általában van. Megtalálható azonban a készülék működése alatt, aktuálisan a készülék számítógépének a képernyőjén, mint az aktuális működés egyik lényeges paramétere. Ez pedig a mozgófázis oszlopon való átáramoltatásához szükséges nyomásesés mértéke. Ez az érték függ a mozgófázis viszkozitásától, az áramlás nagyságától, az oszloptöltet, vagyis az állófázis szemcseméretétől, az oszlop töltésének a minőségétől, azaz a permeabilitásától. Aktuális témánk szempontjából most talán a legfontosabb a permeabilitás, ami egy használt oszlop esetében már nem a töltés jóságának, hanem az oszlop romló állapotának, vagyis az öregedésének a jellemzője, értékével jelentősen szerepet vállalva az oszlopon kialakuló „patológiás” nyomásesésnek. De mint azt fentebb már hangsúlyoztuk, az oszlop úgymond magas „vérnyomása”, vagy analógiában ezzel a magas „mobilfázis nyomása”, a kromatogramból nem derül ki. Kiderül viszont az oszlop sok egyéb baja. Általában a különböző defektes csúcsalakokon keresztül, amelyeknek a megjelenésére az a jellemző, hogy a kromatogram valamennyi – általában nagyobb – csúcsára jellemző lesz. A kisebbekre is, de azoknál arányosan kevésbé vehető észre.

Egy egészen „egyszerű”, de annál fontosabb kérdés felvetésével most megelőzzük a „csúcsalakrondulás” részletesebb tárgyalását. Persze az egyszerű jelzőt nem véletlenül tettük idézőjelek közé. Egyszerűnek tekintünk valamit, ha tisztában vagyunk a hátterével, és bonyolultnak, ha nem. Szóval a felvetés, amely talán minden kromatogram értékelése esetén az első, mondjuk eredendő kérdés, az a következő, tömören fogalmazva. „Vajon a vizsgált minta minden komponense jelen van a kapott kromatogramon, és minden a kapott kromatogramon jelen lévő csúcs a vizsgált minta komponensétől származik-e?” Ez a kérdés már eddig is szinte átitatta a gondolatainkat. Nem véletlenül, vagy inkább nem ok nélkül. Egy gyakorló kromatográfusnak, akármilyen biztos is a dolgában – ha nem tesztmintát vizsgál – akkor ezt a kérdést kell – egy frissen kapott kromatogram esetén az értékelés kiindulásként – feltennie. Különösen, ha egy adott feladat megoldásának a kezdetén tart még. Egyébként ezt a kérdést ilyenkor akkor is felveti egy „gondos”, azaz kételkedő kromatográfus, ha azt igazából ki se mondja, csak egyszerűen először tekinti meg az „újszülött” kromatogramot. Különösen érvényes a felvetés, amennyiben első ránézésre ezzel az „újszülöttel” valami nem stimmel.

Persze nem szabad elfelejteni, hogy egy praktizáló kromatográfust – mint egyébként minden analitikust – a szakmai tudásán, és rutinján kívül azok az előzetes ismeretek is segítik a munkájában, amelyek kíséretében az adott feladatot megkapta. Egy analitikai feladat éppen attól konkrét, hogy ezek az ismeretek vagy „peremfeltételek” a vizsgálandó mintára rendelkezésre állnak. Kérdés, ha igen, akkor mennyire. A hétköznapok szóhasználatában ez általában úgy jelentkezik, hogy a feladat megoldását a kályhától kell-e elkezdeni, vagy „hol van az már”. Egy feladat megoldását általában a megfelelő módszer kidolgozásával kell kezdeni. Tulajdonképpen akkor is, ha azt már mások megtették. Különösen, ha nemcsak mások, de máshol is. Reprodukálni egy meglévő módszert, ami esetleg egy teljesen más típusú kromatográfon lett kidolgozva, az pestiesen szólva azért „nem mindig piskóta”. Különösen, ha egy kicsit összetettebb módszerrel van dolgunk – amilyen például egy gradiens elúció lehet – akkor bizony sok váratlan esemény érhet bennünket a reprodukálási akció folyamán.

Szóval „lenni vagy nem lenni”? Vagy kevésbé irodalmi nyelven, és kevesebb különböző szóval fogalmazva „vagy, vagy, nem vagy?” tehetjük fel a kérdést egyenként a kromatogramban megjelenő csúcsoknak, és a „van itt még valami?” kérdést, az esetlegesen nem megjelenőknek. De a lényeg ez eset(ek)ben is a válaszon van, amit természetesen nekünk magunknak kell megadni. Részint a már meglévő, részint a további ismereteink alapján.

Azért amikor a csúcsok eredetéről fecsegünk, nem hallgathatjuk el azt a nyilvánvaló tényt és persze fontos igényt, hogy nem baj, ha egy laborban nemcsak anyagilag van rend, de egyébként is. És persze a fejekben is. Persze ez az állítás nyilván nemcsak a kromatográfiás laborok esetében igaz, és tulajdonképpen triviális. Azonban különösen igaz egy kromatográfiás labor eszközeire, a pumpákra, az injektorokra, de legfőképpen az oszlopokra. Majdnem tekintet nélkül arra, hogy melyik kromatográfiás technika eszköze. Bár kétségtelen, hogy egy gázkromatográfiás oszlop rendbehozatala ugyanúgy „egyszerűbb” feladat egy HPLC-s oszlop rendbehozatalánál, mint amennyire a technikák alapvetően viszonyulnak egymáshoz. A fentiek azért tartoznak egy kromatogram „csúcseredet”vizsgálatához, mert olyan csúcs, amelynek „okozója” nem komponense az injektált mintának, az leginkább egy használt és koszos, vagyis gondatlanul karbantartott oszlopról származhat. De persze nem csak onnan. Származhat például az előző injektálásból, vagyis végül is ugyancsak az oszlopról. De a helyzet igazán különböző. Csak a következmény ugyanaz: egy szellemcsúcsos kromatogram. Az előbbi esetben az oszlop volt gondatlanul (koszosan) tárolva, az utóbbiban egy futtatás nem lett rendesen befejezve. Persze ezt meg kell állapítani.

Amennyiben egy kromatogram értékelésénél szellemcsúcsra gyanakszunk, akkor legelőször is meg kell ismételni az előző minta injektálását, lehetőleg jól. Azaz lehetőleg nem használni olyan eszközt, ami gyanús lehet. Kézi injektálás esetén például egy másik, lehetőleg „minden gyanú felett álló” fecskendőt viszont igen. És mást se, ha a gyanú egyáltalán felvethető vele szemben. Például nem ugyanazt a mintaoldatot és/vagy nem ugyanazokat az oldószereket. A szellemcsúcs eredetének a nyomozása persze azzal az eredménnyel is járhat, hogy a kérdéses csúcs mégsem az, de ezt aztán alaposan bizonyítani is szükséges. Mint ahogy persze az ellenkezőjét is, vagyis azt, hogy a kérdéses csúcs mégiscsak egy szellem a kromatogramunkban. Ilyenkor egy MS detektor – a laborban – nem hátrány. Igaz, máskor sem! Már csak azért sem, mert egy ismert komponenseket tartalmazó minta vizsgálata mégiscsak megnyugtatóbb, de legalábbis kisebb feladat, mint az, amikor a minta komponensei egy részének a szerkezetére még a sokadik injektálás után is csak tippelni tudunk. Sajnos sokáig nem volt ritka, hogy ezt egy analitikai laborban mindenki akceptálta, kivéve a főnök! Szerencsére manapság egy analitikai labor szakmai igényeihez többé-kevésbé megfelelő műszerpark és főnök tartozik. Sajnálat a kivételnek!

Egy kromatogramban azonban egy vagy több csúcsnak nemcsak a jelenléte lehet változó, de a mennyisége is. Ez, amennyiben egyértelműen és folyamatosan csökkenést jelent más változás nélkül, akkor ez egy valahonnan származó szennyezés kihígulásának az észlelése, amely például származhat az injektorból, kézi injektálás esetén a fecskendőből, esetleg a detektor cellájából.

Amikor egy párhuzamos méréssorozat valamelyik injektálásából keletkezett kromatogramban egy, esetleg két olyan csúcsot fedezünk fel, amelyet/amelyeket a korábbiak nem tartalmaztak, megint gyanakodnunk kell valamire. Injektálunk tehát további párhuzamosakat. Aztán megállapítjuk a további kapott kromatogramokból, hogy a korábban észlelt úgymond jövevény csúcs/csúcsok területe, és ezzel a mennyisége, majdnem folyamatosan nő, míg más csúcs/csúcsok területe, és így a mennyisége pedig csökken. A következtetés majdnem triviális, a mintánk bomló komponenst vagy komponenseket tartalmaz. Egy idő után aztán a bomlástermék vagy termékek mennyisége is nagyobb lesz a kimutatási határnál. Az ilyen esetben vagy esetekben aztán a mintánk a módszer körülményei között nem stabil. Ezért a kérdéses módszer nem validálható. (A validálás rejtelmeiről sorozatunk egy későbbi részében fogunk szólni!) A mintát egyébként egy ilyen felismerés után – stabilitásának vizsgálata okán – alaposan és sokféleképpen szokták gyötörni. Vegyileg és/vagy termikusan, hogy a bomlási „disznóságok” minél gyorsabban és széleskörűen kiderüljenek.

Csúcstorzulások
Egy magára valamit adó kromatográfus célja nem lehet más, mint mind esztétikailag, mind pedig szakmailag elfogadható kromatogram készítése. Hol van már az az idő, amikor a keletkezett kromatogramot – ha egyáltalán sikerült papírra vetni – tekintélyes tintapacák tették látványossá és egyben értékelhetetlenné, pedig eredendően olló és megfelelő mérleg is rendelkezésre állt az értékeléshez. „Szerencsére” a kromatogram készítése és értékelése már egy jó ideje automatikusan történik. Természetesen azért az automatizmus hátterében mégiscsak egy kromatográfus döntései, beállított paraméterei vannak. Előnyként és hátrányként egyaránt, esetenként az egyik vagy a másik dominálva. A csúcstorzulások kialakulása esetén például, sajnos az utóbbi kerülve előtérbe, ugyanis a csúcstorzulások nem az adott kromatográf analitikájának a termékei. A többes szám alkalmazásával egyébként nem a kromatográfus „érdemeit” kívántuk felnagyítani, de ha egy kromatogramban csúcstorzulást találunk, az minden „komolyabb” csúcsra jellemző lesz, feltéve, hogy az az oszlop állapota okán alakult ki. Minthogy természetesen akkor is, amikor ez a jelenség nem jelentkezik a kromatogramban, csak ilyenkor persze pozitívan értelmezve az oszlop állapotát. Illetve persze természetesnek véve, hogy az adott oszlopunk „tökéletesen egészséges”. Sőt, esetenként – például egy „rázós” elválasztás sikeres megoldása után – ha nem is kimondva, de azt is megállapíthatjuk, hogy az adott oszlop éppen csak, vagy még úgymond „ereje teljében van”. Mert bizony nemcsak a mosónők halnak korán, de a gondatlanul és rosszul karbantartott oszlopok is!

A csúcstorzulások lehetnek úgymond mai zsargonnal fogalmazva, nagyon durvák, ha az például csúcsfelhasadás, és lehetnek kevésbe rémisztőek, mint például a csúcs fel- és leszálló ágának az elnyújtott alakja, amit az angol nómenklatúrából átvéve mi is leadinges- illetve tailinges-csúcsnak neveztünk el. Az előbbi jelenség, vagyis a csúcsfelhasadás – amennyiben a kromatogram egészére jellemző – egyértelműen az oszlop hibája, míg ha csak az egyik csúcs esetében jelentkezik, akkor inkább az adott csúcshoz rendelhető anyag valamilyen szerkezetátalakulására utal az elválasztás közben. Ez lehet például oxo-enol tautoméria is.

E sorok írója egyébként továbbra is állítja – különösen a folyadékkromatográfiás termékek mai színvonalánál –, hogy egy oszlop állapota, ha nem kellett korábban egy rázós feladat sorozatméréseiben „mártírhalált” szenvednie, akkor kizárólag a kromatográfus gondatlanságának és/vagy „hozzá nem értésének” lehet az áldozata. Persze nemcsak az oszlop megfelelő karbantartásának, ápolásának elmaradása lehet az oka egy oszlop tönkremenésének, idő előtti öregedésének, hanem a gondatlan minta-előkészítés és a nem megfelelő metodika alkalmazása is.

Eléggé közismert, hogy mindegyik elválasztástechnikai készülék igencsak jó néven veszi, ha az injektálást „tökéletesen” tiszta oldattal végezzük. A kromatográfusok némelyike azonban úgy gondolja, hogy a mintaoldat – az injektálást megelőző – centrifugálása vagy szűrése megváltoztathatja annak eredeti összetételét. Sajnos ez nem lehetetlen esemény, de ez a „hipohonderség” azért néhány különleges esettől eltekintve ugyanúgy túlzás, mint egyébként az életünkben is az.

A csúcsfelhasadás ha tehát általános egy kromatogramon belül, akkor a mozgófázis szabad, úgymond szimmetrikus áramlásának a részleges akadályoztatása okán alakul ki. Ez azonban csak az injektálást követően vehető észre, mert a mozgófázis önmagában csak alapvonal jelet ad. Az oszlop erősen, de egyelőre még csak részlegesen eltömődött bemeneti szűrője a konkrét okozó. Részleges, mert áramlás még van, de ahhoz már elég a dugulás, hogy az oszlop ne a teljes keresztmetszetében engedje be az eluenst, kiváltva ezzel az egyértelműen káros visszakeveredést, és ez által a generális csúcsfelhasadást. Hogy a felhasadt csúcs egy anyagot tartalmaz, azt például legalább három azonos színképpel igazolhatjuk. Az ok pedig az, hogy az oszlopra korábban injektált mintát, az oszlop bemeneti szűrőjének kell a szilárd – szabad szemmel nem is látható – szennyezésektől „megfosztania” a kromatográfus helyett!

Az oszlop kimeneti szűrőjének az elkoszolódása szintén csúcstorzulást okozhat, amikor az azon áthaladó, tehát az oszlopból kilépő minta komponens(ek) – az egyébként ismeretlen szennyezésből – „magával húz(nak)” valamennyit. Ilyenkor a keletkezett csúcs(ok) leszálló ágában keletkezik egy kisebb-nagyobb váll. De láthatóan nem egy másik kisebb, majdnem önálló csúcs. Ez a jelenség is általános a kromatogram csúcsaira.

Visszakeveredést és ezért jellegzetes csúcstorzulást az oszlop belselében kialakuló holt terek is okoznak. Ezek az álló-fázis oldódása miatt is keletkeznek.

Egy kromatogramból azonban az adott rendszerre vonatkozóan nemcsak „patológiás”, de „fiziológiás” jellemzőket is ki lehet olvasni, mint amilyen például a rendszer hatékonysága (N) és az adott módszernek az adott mintára illetve az adott komponenspárokra kialakuló felbontása.

Nem szóltunk még a kromatogram-olvasás azon részleteiről, amelyek egyrészt az áramlás, vagyis a pumparendszer működésének a vizsgálatát szolgálják, valamint azokról a kiolvasható jellemzőkről, amelyek az adott módszer jóságát illetve a feladat megoldását szolgálják. Mindezekről később beszélünk.

(folytatjuk)
Pásztor József

Regisztráció
HÍRLEVÉL REGISZTRÁCIÓ
Keresés
Mit:
Hol:
gyogyszercimke Chemgeneration