Bemutatkozás/Labinformálódás/Kromatográfia sorozat 45. rész



Minta-előkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC), 45. rész: „Van, aki forrón szereti”!

 

A kromatográfia – mint azt korábban már említettük – a színírás tudománya. Ezt az elnevezés eredeti görög jelentése okán állítottuk, és állítjuk most is. Ez az elnevezés azonban ma már lehetne akár refraktometrikus írás, lumineszcenciás írás, elektrometrikus írás és egyre szélesebb alkalmazási területen tömegspektrometriás írás. Az eredendő - és ma is használatos - elnevezésért az UV/VIS, vagyis az ultraibolya/látható fény alkalmazásával kialakuló komponens „színek” a felelősek. Akármire is kereszteljük azonban aktuális kromatográfiás módszerünket, annak lényege a vizsgálandó minta komponenseinek a sorba rendezése, vagyis egy megfelelő felbontásokkal (RSi,j) rendelkező elválasztó módszer kidolgozása és alkalmazása. Ez a felbontás pedig tulajdonképpen nem más, mint - komponenspáronként - az elválasztó (sorba rendező) kromatográfiás rendszerünk hatékonyságának és szelektivitásának a szorzata (45.1).

A „megfelelő” jelzőt természetesen kizárólag egy adott mintával kapcsolatban kell érteni. Vagyis általában megfelelő elválasztó (sorba rendező) rendszer nincs. Egyet az adott mintára vagy mintatípusra az analitikusnak mindig ki kell dolgoznia. Lehetőleg minél jobban és minél gyorsabban. Persze elmondhatjuk, hogy létezik egy olyan típusú módszer, vagy inkább módszercsalád, amely a többinél szélesebb alkalmazási területtel rendelkezik. Ez pedig a fordított-fázisú folyadékkromatográfia területe. Ez az elnevezés pedig – kialakult konvenciók szerint – olyan elválasztó rendszerre vonatkozik, amelyet hidrofób(abb) álló- és hidrofil(ebb) mozgó-fázis alkalmazásával alakíthatunk ki. Ez – az említett – szélesebb alkalmazási területét a víznek mint a természetes világ oldószerének köszönheti. Egy kissé általánosítva/egyszerűsítve a kérdést. Visszatérve a felbontás kérdésére, a (45.1) összefüggés szerint az a következő:

RSi,j=0.25N0.5(αi.j – 1)[k’/(k’ + 1)] (45.1)
............(I).........(II).........(III)

A kifejezés – mint azt jeleztük – három tényező (I, II, III) szorzatából áll. Ezek sorrendben a következők: hatékonyság (N), szelektivitás (α) és retenció (k’). Amennyiben elválasztó rendszerünkre olyan módszert dolgoztunk ki, amely az adott mintánk/mintáink komponenseinek sorba rendezésére megfelelő RSi.j értékeket produkál, és ezt reprodukálhatóan teszi, akkor egy nagy lépést tettünk feladatunk megoldása felé. Mondhatni befordultunk a célegyenesbe. De még nem értünk a célba, ugyanis napjaink kromatográfiája egy kidolgozott módszertől megköveteli az analízisidő rövidségét, vagyis azt, hogy az analízis, esetünkben a sorba rendezés, a lehető leggyorsabban legyen végrehajtható, és ezáltal az elválasztásra kerülő minták számát – az időegység alatt – a „végletekig” növelhessük. Amint az az analízis kis időszükségletéből automatikusan következik. De nem csak azért.
A gyorsasággal – mint azt látni fogjuk – egyúttal növeljük a módszer érzékenységét, és csökkentjük az oldószerigényét. Persze nem „ingyen”. Mondhatjuk, valamit valamiért.

4664d09608557ed1b69e1cddc9365d3a
45.1 ábra


A 45.1 ábrán a kromatográfia ma már klasszikusnak számító háromszöge látható, amely még akkor is jellemzője a technikának, ha a háromszög csúcspontjaiban elhelyezett fogalmakkal szemben mára a korábbiaknál „komolyabb” elvárásaink alakultak ki. Különösen igaz ez a nyomás esetében. Ugyanakkor a fogalmak közötti kapcsolatok ma is érvényesek. Amennyiben például az analízisidő csökkentése a cél, akkor kénytelenek vagyunk növelni a mozgó-fázis áramlási sebességét, ami a Knox-egyenlet értelmében egyértelműen rontja a módszer eredeti felbontásait (RSi,j), és növeli a nyomásesést (ΔP) az oszlopon/rendszeren. Mindez, egészen napjainkig lényegesen meghatározta a sorba rendezés kromatográfiás technikájának lehetőségeit. A kromatográfia azonban technikailag „kinőtte” ezt a fenti háromszöggel kapcsolatos korábbi elvárásunkat. Egyszerűen azok más megvilágításba kerültek. Mégpedig az elválasztástechnika gyakorlatának fejlődése okán. Ezt egyébként a kromatográfiás műszerek technikai fejlődésének is tekinthetjük. Mindenesetre hangsúlyozni kívánjuk, hogy a kromatográfia nem elméletileg újult meg. A megnövekedett igények kielégítése – mint azt rendszeresen hangoztatjuk – folyamatos technikai fejlődést „provokált”. Az egyre összetettebb minták komponenseinek a sorba rendezése mindenképpen a kromatográfiás rendszer felbontóképességének a „javítását” igényelte, illetve persze igényli ma is. Bár esetenként a multidimenzionális analízis alkalmazása nem elkerülhető. A továbbiakban a megállapításaink jelentős része kizárólag izokratikus elválasztási körülmények között érvényes! Az RSi,j „javítására”, azaz növelésére, tehát a kromatográfiás rendszer hatékonyságának a növelésére van szükség. Erre kétféle módon van lehetőségünk. Az RSi,j egyrészt egyenesen arányos a rendszer hatékonyságának (N) négyzetgyökével. Vagyis:

RSi,j~√N (45.2)

Másrészt, miután a hatékonyság fordítottan arányos az álló-fázis szemcseméretével, vagyis

N~1/dp (45.3)

A felbontás (RSi.j) tehát fordítottan arányos a szemcseméret négyzetgyökével. Ezért

RSi,j~1/√dp (45.4)

Amennyiben negyedére csökkentjük az álló-fázis szemcseméretét (átmérőjét), akkor a kromatográfiás rendszer felbontóképessége – azonos szelektivitás és retenció mellett – a kétszeresére fog nőni.

A hatékonyság növelését a rendszer kinetikai paraméterei-nek a javításával – például a hőmérséklet növelésével – érhetjük el. Mint erről az alábbiakban szólni is fogunk.

A másik lehetőség az álló-fázis szemcseméretének a további csökkentése. Azonban eredendően sem a sorba rendezés hőmérsékletének az emelése, sem az álló-fázis „aprítása” nem problémamentes megoldás egy folyadékkromatográfiás rendszer felbontóképességének a növelésére.

A HPLC technikájának napjainkban végbemenő fejlődése(i) elsősorban ezeknek a problémáknak a kiküszöbölésére (enyhítésére) irányul(nak).

Kezdjük vizsgálódásunkat az utóbbival, vagyis a szemcseméret csökkentésének a kérdésével. Az álló-fázis részecskeméretének a csökkentése a következőket okozza:

1.         nagyobb hatékonyság,
2.         gyorsabb analízis,
3.         megnövekedett nyomásesés,
4.         nagyobb igények a műszerrel szemben.

Megállapításaink zöld színével azok pozitív, piros színével pedig a negatív hatásukat kívántuk érzékeltetni.

Ad. 1. Nagyobb hatékonyság.
A Knox-egyenletre már hivatkoztunk, hát akkor most nézzük meg, mi is az.
A Knox-egyenlet végül is egy adott szemcseméretű oszlop tányérmagasságának a változása, a mozgófázis lineáris sebességének a függvényében, vagyis H=f(u), ahol

H=L/N (45.5)

a desztilláció technikájából vett analógiával az egységnyi hatékonyságra eső oszlophosszúság, vagyis a tányérmagasság, azaz az elméleti tányérmagasság. Ez – mint már említettük – közelítőleg arányos az álló-fázis szemcseméretével, és függ a mozgó-fázis lineáris sebességétől, u-tól, valamint az oszlop és a töltet tulajdonságára jellemző paraméterektől. Azonban mégsem teljesen így. A Knox-egyenlet végül is a következő:

h=Aν1/3+B/ν+Cν (45.6)

A (45.6) összefüggésben tehát u, a mozgófázis redukált sebessége:

ν=udp/Dm (45.7)

ahol az ismert paraméterek mellett, a Dm a mozgó-fázis diffúziós koefficiense. A, B és C az oszlop minőségére jellemző paraméterek, a h pedig az oszlop redukált tányérmagassága:

h=H/dp (45.8)

A (45.6) összefüggésből nyilvánvaló, hogy az A, a B és a C, mint az oszlop minőségére (töltésére) jellemző paraméterek, akkor jellemeznek minél hatékonyabb oszlopot, ha minél kisebb az értékük. Persze nullánál mindenképpen nagyobbnak kell lenniük. Az A, az ún. eddy diffúzió állandója, a B a tengelyirányú diffúzió állandója, míg a C tulajdonképpen a tömegátadási folyamat (fázisátmenet) sebességi állandója. Egy „megfelelő képességű” oszlop esetében az A 0,4–1,0 közötti, a B 2,0–3,0 közötti, míg a C 0,04–0,10 közötti érték lehet. A (45.6) egyenlet egyébként ebben az alakjában egy összetettebb egyenlet egyszerűsített alakja. Elméletileg egyébként érdekes, és némiképpen nyitott kérdés, hogy az említett A, B, C paraméterek értékei függenek-e a k’ értékétől, vagy nem. A különböző dp értékekhez azonban egyértelműen különböző helyzetű és alakú h-ν görbék tartoznak. Ez a tény pedig napjaink folyadékkromatográfiás fejlődésében, és ilyenformán jelenlegi tárgyalásunkban igencsak kulcsszerepet játszik. A H-u, illetve h-ν görbék mindegyike 1 minimummal rendelkezik.

Ennek a minimumnak a helye és értéke a szemcseméret (dp) függvénye. Kisebb dp értékhez rendelhető görbe minimumához kisebb H, illetve h és nagyobb u, illetve n érték tartozik. Ezen túl minél kisebb dp-jű görbéről van szó, annál laposabb a görbe, tehát kevésbé éles a minimum.

Következtetések: minél kisebb a töltet szemcsemérete – azonos feltételek mellett –, annál hatékonyabb az elválasztási rendszerünk oszlopa, és annál kevésbé romlik ez a hatékonyság, amennyiben az optimálisnál nagyobb áramlási sebességet alkalmazunk.

Ad. 2. Gyorsabb analízis.
Az előbbi okfejtés és következtetés alapján, kis szemcseméretű álló-fázis esetén (dp ≤ 2 μm), az analízis sebessége anélkül növelhető, hogy a hatékonyság lényegesen csökkenne. Laposabb h-u görbe.

Ad. 3. Megnövekedett nyomásesés.
Bár a sorba rendezés időszükséglete tényleg lényegesen csökkenthető, amennyiben „igen aprócska” szemcseméretű álló-fázist alkalmazunk a kromatografálásunk során, de ezt a lehetőséget természetesen a fizika nem adja ingyen. Az ilyen akciónak súlyos, vagy esetünkben inkább nyomós következménye van. Az alkalmazott álló-fázis szemcseméretének a csökkentése ugyanis maga után vonja az oszlopon kialakuló nyomásesés, (45.9) összefüggés szerinti megnövekedését.

ΔP=uLη/K0dP2 (45.9)

Amennyiben tehát – azonos egyéb feltétel mellett – kétszeresére növeljük az áramlási sebességet vagy az oszlop hosszát, a kialakuló nyomás is a kétszeresére nő. Ezért, ha gyors kromatográfiát kívánunk „elkövetni” a nyomásesés megnövekedése nélkül, akkor – azonos egyéb feltétel mellett – felére kell csökkenteni az elválasztó oszlopunk hosszát. Igen ám, de akkor a sorba rendezésre igénybe vehető hatékonyság is a felére csökken, és nem biztos, hogy elegendő lesz a feladatunk megfelelő megoldására. Ezért – a korábbiak alapján – kisebb szemcseméretű álló-fázist kell alkalmazni. Ez azonban igencsak nyomásnövelő megoldás. Egy 10 μm - 2 μm csökkentési lépés ötszörös csökkentést jelent. És mint ilyen, ez – a (45.9) szerint – huszonötszörös nyomásnövekedést okoz. (Azonos egyéb feltételek mellett.) A megoldásra két lehetőség van. Egyrészt ne legyenek azonosak azok a bizonyos „egyéb feltételek”, másrészt, vagy fogalmazhatunk úgy is, hogy és/vagy teremtsük meg a lehetőségét annak, hogy a „klasszikus méreteknél törpébb” álló-fázis alkalmazása okozta nyomásnövekedés technikailag elviselhető legyen. A megoldás ezen utóbbi megközelítése egy új folyadékkromatográfiás készülék típus kialakulásához vezetett. Amennyiben az eddigi folyadékkromatográfok 600 bar nyomás felett technikai – és semmiképpen sem elméleti – okból nem voltak használhatók, mégis HPLC, vagyis nagy nyomású folyadékkromatográf elnevezéssel volt dolgunk, akkor az új készüléktípusok, amelyek minimum 1000 barig üzemeltethetők, a VHPLC, vagyis a nagyon nagy nyomású folyadékkromatográf nevet érdemlik. Még akkor is, ha cégenként végül is más névre keresztelték őket (lásd később!). A másik, előbb említett megoldás, miszerint célirányosan változtassunk az analitikánk „egyéb körülményein” szintén jogosan merült fel a kromatográfia elméleti és gyakorlati megvalósítóiban.

A (45.9) összefüggés alapján két fogalom maradt a nyomás értékének a változtatására, csökkentésére. Ezt a két fogalmat a η és K0 betűk jelzik. A K0 a kromatográfiás oszlop permeabilitási koefficiens értéke, az oszlop ellenállását, illetve inkább az elektronikából vett analógiával „vezetőképességét” jellemzi értékével. Ezáltal a kromatográfiás töltet álló-fázis porozitását, tehát a töltet jellegét is magába foglalja. Az ún. monolitikus, vagyis nem szemcsés kromatográfiás álló-fázis előnye éppen sajátos porozitásában rejlik, amelynek a következtében a permeabilitása sajátságosan nagy. Alkalmazásával lehetőség nyílik a megszokottnál nagyobb áramlási sebességeken történő kromatografálásra. A η a (45.9)-ben a mozgó-fázis viszkozitását jelöli. Az aktuálisét, mert az még adott oldószer-összetétel esetén sem egy állandó érték. Nagysága függ az alkalmazás, vagyis az oszloptér hőmérsékletétől, amennyiben magasabb hőmérséklethez – azonos összetétel mellett – kisebb viszkozitás tartozik. Ezt használhatjuk ki – amennyiben lehetséges –, amikor az aktuális kromatográfiás sorba rendezésünket nagyobb áramlási sebességgel és magasabb hőmérsékleten végezzük el. A hőmérséklet emelésével a η értéke csökken, vagyis a (45.9) tört számlálójában kompenzálni tudjuk az u növelését és a ΔP azonos, vagy csak kissé lesz nagyobb, mintha szobahőmérsékleten növelnénk a mozgó-fázis áramlási sebességét.

Ad. 4. Nagyobb igények a műszerrel szemben.
Egy új generációs analitikai folyadékkromatográfiás készülékkel szembeni technikai elvárásainkat a 45.1 táblázatban foglaltuk össze.

45.1_tablazat
45.1 táblázat

A táblázatban természetesen csak a gyors kromatográfia technikájával kapcsolatos tulajdonságokat soroltuk fel. Nem tartalmazza például az oszloppal, illetve az álló-fázissal kapcsolatos elvárásokat, mivel azokat külön tárgyaljuk. (Így is számos kiegészítést fogunk tenni a táblázattal kapcsolatban.)

Egy kromatográf injektora a készülék sebességmeghatározó egysége. Az injektor ún. ciklusideje a leghosszabb minden automata kromatográf esetén. Persze nem azért, mert az injektor a „leglustább” egység, hanem azért, mert egy ciklus alatt, amely ciklus egyik injektálástól a következőig tart, az injektornak van a legtöbb kötelezően elvégzendő feladata. Éppen ezért az injektor képességei – bár eddig is lényegesek voltak – most még inkább azok. Eddig azt vártuk el egy automata injektortól, hogy pontosan és reprodukálhatóan végezze az injektálást, majd a következő injektálásig megfelelően mossa tisztára magát. Az elvárásunk azután még komolyabb lett, ha az automata injektor egyben automata minta-előkészítő is volt. Ma az összes korábbi elvárást a gyorsaság, vagyis – az említett – ciklusidő rövidségének az igénye is kiegészíti.

A pumpával szemben is léteznek – a kezdetektől fogva – konkrét technikai igények. Ezeket mára a szállítási sebesség értékében, de mindenekelőtt a maximálisan kialakítható munkanyomás esetében kellett revideálni. Ma egy kromatográfiás pumpától elvárjuk, hogy vagy a ml legyen a működési tartomány jellemző egysége, vagy képes legyen akár 5 ml/min gyors áramlási értéket produkálni és maximálisan – az eddigi 400 vagy 600 bar helyett – 1000 bar nyomáson működni.

Az oszloptér egy gázkromatográf alapvető és – a dolog természeténél fogva – talán a legfontosabb egysége. A folyadékkromatográfiában sokáig az opciók kategóriájába sorolták. Azok közé az egységek közé, melyek úgymond jó, ha vannak, de a hiányuk nem meghatározó egy HPLC esetében. Az elválasztó oszlop termosztálása folyamatosan vált a folyadékkromatográfiás módszerek igényévé. Magyarországon már csak a hiányzó labortermosztálás okán is. Aztán egyre több laboratóriumot tettek emberbaráttá, vagyis termosztálttá, az oszloptermosztátok igénye azonban megmaradt. Megmaradt, mert a folyadékkromatográfia technikájában az elválasztás hőmérséklete is a körülmények egyik változója lett. Mindenekelőtt a reprodukálhatóság „fokozása” érdekében. Végül is a folyadékkromatográfia alapvetően nem illékony és/vagy termikusan stabil vegyületek analitikájára találtatott ki. Aztán, ha valami beindul… Szóval a hőmérséklet minden korábbinál egyre fontosabbá vált a folyadékkromatográfia technikájában (is). Az oszloptermosztát nemcsak a GPC és az ionkromatográfia esetében kapott szerepet, de majdhogynem kötelező része lett minden HPLC készüléknek.

A detektor a kromatográf mérőegysége. Mint ilyennek, olyan képességekkel kell rendelkeznie, hogy megfeleljen a többi egység igényeinek, mint amilyen a sorba rendezés gyorsasága és a sorba rendezés térfogati igénye. Másképpen fogalmazva, egy modern kromatográfiás detektornak legyen gyors elektronikája, és belső térfogatával ne hígítsa a beáramló mozgó-fázist, de az sem baj, ha a cellája a kis térfogata mellett „valamennyi” nyomást is elvisel. Az összekötő vezeték(ek)től szintén azt várjuk el, hogy belső térfogatukkal ne okozzák az oszlopból kilépő mozgó-fázis „túlzott”/aránytalan hígulását. Ezt a belső átmérőjük és hosszuk megfelelő kialakításával valósíthatják meg.

Egy modern kromatográfiás szoftverrel szemben felmerülő legfontosabb felhasználói igény egyrészt az, hogy az adatgyűjtés és az adatfeldolgozás legyen kompatibilis a módszerünk gyorsaságával, másrészt, hogy a rendszerirányítás értelemszerűen legyen hasonlóan gyors. Persze a könnyen kezelhetőség szintén nem lebecsülendő igény egy szoftver esetében (sem).

Egy folyadékkromatográfiás módszer kidolgozásának a következő lépései léteznek.

1. Az analitikai feladat kromatográfiás „átfogalmazása”.
2. A kromatográfiás módszer kiválasztása.
3. A kromatográfiás oszlop kiválasztása.
4. A kromatográfiás körülmények kiválasztása.
5. A detektálás körülményeinek a kiválasztása.
6. A kromatográfiás értékelés körülményeinek a kiválasztása.
7. Az analitikai feladat kérdésének a megválaszolása.

Ezek a lépések önmagukban is több lépésből állnak, és tulajdonképpen egy-egy feladatkörét jelentik a kromatográfiának. Egymás után megoldandó feladatköreit. Tulajdonképpen – mint azt már annyiszor hangsúlyoztuk – az 1–6. lépések addig igénylik az ismételt meglépésüket, amíg a 7., azaz felsorolásunkban a befejező lépés „maximális bizonyossággal” meg nem tehető.

Ad. 1. Az adott tudományterület művelői felteszik a kérdést (felvetik a problémát) az analitikának. Az analitikusok „kiszignálják” a kérdést/problémát a kromatográfusoknak. Ez utóbbiak, a kapott kérdést/feladatot az elválasztástechnika nyelvezetére fordítják le.

Ad. 2. A „kromatográfiás nyelven” megfogalmazott kérdés/feladat megoldására legkézenfekvőbb kromatográfiás technika kiválasztása.

Ad. 3. A kiválasztott kromatográfiás technika sorba rendező egységének vagy egységeinek a kiválasztása.
a.
, Az álló-fázis típusának a kiválasztása.
b., Az álló-fázis méreteinek a kiválasztása.
c., Az oszlop méreteinek a kiválasztása.
Az álló-fázis konkrét kiválasztása elméleti módon ugyan megtervezhető, de próbafuttatás vagy próbafuttatások nélkül nem konkretizálható. Értve ez alatt az álló-fázis szemcseméretét és az oszlop méreteit. Persze a napi gyakorlatban azzal kell dolgozni, ami rendelkezésre áll.

Ad. 4. A kromatografálás körülményeinek a kiválasztására nagyjából hasonló megállapítások vonatkoznak, mint amiket az előző pontban említettünk.

a., A mozgó-fázis kiválasztása.
b., A mozgó-fázis összetételének pontos (konkrét) megválasztása. Egy folyadékkromatográfiás módszer esetében a mozgó-fázis lehet állandó összetételű, vagy változó összetételű. Az előbbit izokratikus, az utóbbit gradiens módszernek nevezzük. Az utóbbi tovább különbözhet az összetétel időbeli változása szerint.
c., Az esetleges gradiens kezdeti és végső oldószer-összetételének a megválasztása.
d., A gradiensprofil kialakítása.
e., A sorba rendezés hőmérsékletének a megválasztása, izoterm elválasztás esetén. Ilyenkor a hőmérséklet állandó.
f., A gázkromatográfiához hasonlóan hőmérséklet-változás kidolgozása. A különböző hőmérsékletek megválasztása, és a változás alakjának a megválasztása (erősen készülékfüggő!).

Ad. 5. A detektor típusát – elméletileg – a vizsgálandó anyagok ismerete, illetve tulajdonságai, valamint a feladat igényei, de – gyakorlatilag sajnos – legtöbbször a lehetőségeink alapján választjuk meg. A XXI. század detektora – ha nem is kizárólag, de – egyértelműen a tömegspektrométer valamilyen típusa. Ez összetettségénél fogva a legegyszerűbb esetben is igényli a működési paraméterek beállítását, valamint a módszerünk mozgó-fázisának a detektorral kompatibilis kiválasztását. Ez persze nem valami újdonság, hiszen ezt a többi detektortípus esetében régebben és most is meg kellett, illetve kell tenni. Az MS esetében a körülmények megválasztásának az igényei talán szigorúbbak, mint azt talán más detektor esetében megszoktuk.

Ad. 6. A kromatográfiás értékelés ma már szinte kivétel nélkül profi módon végezhető el. Ehhez számos megfelelő szoftver áll rendelkezésre, és egészíti ki az analitikai műszereket. Amennyiben a „felhasználóbarátiság” tekintetében ezek persze nem mindig teljesen egyformák. Egy számítástechnikailag is képzett kromatográfus esetében ez nem különösebb probléma. Az ár annál inkább. (Lásd egy későbbi folytatásban!)

Ad. 7. Egy kromatográfiás módszer eredménye „csak” analitikai eredmény. Ezt még az eredeti feladat megválaszolása érdekében, a megbízó tudományág nyelvére vissza kell fordítani. Ahogy azt az 1. pont alatt tettük, csak fordítva. De ez már kilépés az analitika területéről. Még akkor is, ha ma már a tudományterületek igencsak egymásba diffundáltak.

Hőmérséklet
A hőmérséklet a folyadékkromatográfia technikájában sem újonnan előrángatott változója a sorba rendezések körülményeinek. Nemcsak – az előbb már említett – gél- és ioncserés kromatográfia területén alkalmaztak sorba rendezést emelt hőmérsékleten, de – a dolog természeténél fogva – a folyadékkromatográfia fizikai-kémiai alkalmazásainak során is. Azonban az emelt hőmérsékletű kromatografálás, megint csak a dolog természetéből következően – az említett folyadékkromatográfiás területek kivételével – mégiscsak a gázkromatográfia sajátja maradt. A folyadékkromatográfiás alaptankönyvek, az illékonysággal és/vagy termikus stabilitással nem rendelkező vegyületek sorba rendezésére alkalmas módszernek tekintették a kromatográfia ezen területét. Az elmélet azonban egyre jobban a gyakorlat segítője lett. Mindezt pedig a terület műszerezettsége is követte. Az oszloptermosztát pedig megjelent az analitikai laborokban, mint a folyadékkromatográf része. Akár mint egy kompakt rendszer része (HP 1090), akár mint egy modulrendszerű HPLC egyik modulja (Pye Unicam 4000). A kezdeti funkcióként ugyan az oszlop korrekt termosztálását jelölték meg, de a mintastabilitási problémákon kívül semmilyen kontraindikációja nem alakult ki a magasabb hőmérsékletű folyadékkromatográfiának. Annál is inkább, mert a nagy nyomású folyadékkromatográfia működési körülményei között – még új és rövid oszlop esetében is – kialakul akkora nyomás, hogy még a szerves oldószerek se forrjanak fel az oszlopban.

A hőmérséklet-emelés kromatográfiás hatása eredendően kettős, így a folyadékkromatográfiában is az (45.2 ábra).

64cd38caba86a38f663e72bed8151d7d
45.2 ábra


A 45.2 ábrán a hőmérséklet- emelés két elválasztástechnikai hatását, úgymint a kinetikait és a termodinamikait vázoltuk fel. A kinetikai hatás mindenképpen a kromatográfiás folyamatok felgyorsulását jelenti emelt hőmérsékleten, a szobahőmérséklethez képest, ez a komponensek retenciójának a kollektíven történő csökkenését is okozza, amennyiben azokat egyébként termodinamikai hatások nem befolyásolják (lásd később). Különösen biológiai polimerek, fehérjék, nukleinsavak esetében növekszik a diffúziójuk jelentősen, a hőmérséklet emelésével. Amennyiben a gyors folyadékkromatográfia – amit talán UHPLC-nek is rövidhetünk az Ultra Magas Nyomású Folyadékkromatográfia angol szavainak kezdőbetűi alapján – megvalósításának a szempontjából tekintjük az elválasztó oszlop hőmérsékletét, akkor mindenképpen a gyors és kis szemcseméretű álló-fázison keresztül történő áramlás okozta nyomásesés nagyságának a fizikai okát kell keresni (45.10).

ΔP= ΦηLu/dp2 (45.10)

A (45.10) kifejezés azonos a korábban bevezetett (45.9)-es kifejezéssel, amennyiben a Φ az oszlop ellenállási faktora és mint ilyen, az oszloptöltés, illetve a szemcseszerű álló-fázis tölthetőségének a jóságára jellemző, akárcsak a (45.9) kifejezésben szereplő K0. Csak éppen fordítva, mert Φ=1/K0. A hőmérséklet-emelés következménye szempontjából a (45.10) összefüggés azért érdekes, mert a tört számlálójában szereplő η, mint a mozgó-fázis viszkozitása a hőmérséklet emelésével csökken. Ennek következtében tehát a mozgó-fázis áramlásért felelős nyomásesés csökkenthető. Ezzel mind az áramlás sebessége (gyors kromatográfia), mind az oszlop hossza, és/vagy az álló-fázis szemcsemérete növelhető, illetve csökkenthető (nagy hatékonyságú kromatográfia). A viszkozitás – nyomásesés – hőmérséklet viszonyának kérdésével kapcsolatban e sorok írója a következő saját kromatográfiás élménnyel rendelkezik.

A minta igen összetett, az oszlop hatékonyságával szemben az igény tehát nagy. Tehát 25 cm-es az oszlop, és 5 mm-es az álló-fázis szemcsemérete. A próbafuttatások után kiválasztott mozgó-fázis etanol-víz 20:80 induláskor és lineáris alakú gradiens profillal 80:20 a kromatografálás végére. A mozgó-fázis viszkozitása azonban olyan mértékben nőtt az etanoltartalom %-os emelkedésével, hogy a kialakult nyomás meghaladta a megengedhető értéket (400 bar), amiért a pumpa (HP 1090) automatikusan leállt. Megoldás: végezzük a sorba rendezést t=60 °C-on termosztált oszlopon (45.3 ábra).

Tekintettel tehát arra, hogy magasabb hőmérsékleten a retenciós idők – azonos egyéb körülmény között – a folyadékkromatográfiában is csökkennek, a hőmérséklet „megfelelő” emelése, a sorba rendezés utáni detektálás, vagyis a kromatográfiás módszer érzékenységének, vagy helyesebben kimutatási határainak a csökkenését, azaz javulását okozza. Ezt a hőmérséklet-növelést egészen addig folytathatjuk, amíg a sorba rendezés el nem romlik. Vagyis a felbontások mindegyike vagy többsége el nem tűnik, vagyis nullás nem lesz. A hőmérséklet „túlzott” emelésével – a gázkromatográfiához hasonlóan – lesöpörhetjük az injektált mintát az oszlopról. Ez egyben lehetőséget ad a kromatográfus számára, hogy egy még „reverzibilisen elkoszolódott” oszlopot, vagyis használt álló-fázist, általában fordított bekötéssel, és megfelelően erős oldószer alkalmazásával emelt hőmérsékleten mosson tisztára.

Az eljáráshoz tartozik az a gyakorlati tanács – általánosan igaz az emelt hőmérsékletű HPLC alkalmazása esetén –, hogy a hőmérsékletet előbb kell csökkenteni, mint ahogy az áramlást leállítanánk, mert ellenkező esetben az oldószerek (a szervesek mindenképpen!) egyszerűen kiforrnak a nyomásvesztett oszlopból. Ez egyébként a detektor cellájában is bekövetkezhet, ha nem valamennyire túlnyomáson működtetjük! Az esetleges visszahűtés menet közben szintén veszélyes lehet oldhatósági problémák miatt! Ezek a „spontán” megjegyzések ismételten azt jelzik, hogy a dolgokat előre átgondoltan célszerű kivitelezni. (A szerk.)

A mi szeretett „színírásunk” lényege, hogy a mintánk komponenseit – a fizikai(-kémiai) tulajdonságaik alapján – sorba állítsuk. A sorba állítás feltétele, hogy a sorba rendező egység tudjon „válogatni” a komponensek között, vagyis rendelkezzen szelektivitással a minta komponenseivel szemben. Ehhez persze a folyadékkromatográfiában ennek a sorba rendező egységnek, az álló-fázisnak nem egyedül kell szelektálgatnia a komponensek között, hanem a mozgó-fázissal közösen. Mert a mozgó-fázis a folyadékkromatográfiában nemcsak hajtja kifelé a komponenseket az oszlopból, de „segít” a fázistársának a minta komponenseinek sorba rendezésében. Mindez (tehát a sorba rendezés „minősége”) azonban eredendően az alkalmazótól, azaz a kromatográfustól függ.

Mit tehet egy kromatográfus? Már felsoroltuk korábban. Az analitikai feladatból készít egy kromatográfiás feladatot. Ennek a megoldásához kiválaszt valamilyen álló-fázist és mozgó-fázist. Aztán megtervezi a fázisok „megfelelő működéséhez” szükséges körülményeket. Ha a minta nem túl komplex, akkor elegendő egy típusú álló-fázis alkalmazása. Ha nem, vagyis túl komplex, akkor több (általában két) álló-fázist kell alkalmazni. A mozgó-fázis is lehet több (általában kettő). Ha a minta sokféle komponenst tartalmaz, de mégsem „annyira komplex”, akkor a sorba rendezéshez elegendő egy típusú álló-fázis, de nem elég egy mozgó-fázis. Az álló-fázis folyamatosan változhat. Az ilyen folyadékkromatográfiás módszert gradiens technikának hívjuk. Egy gradiens technikát a mozgó-fázis kiindulási, közbülső és végső összetételével, valamint a változás (vagy változások) profiljával és az összetétel-változás (vagy változások) idejével jellemezhetjük. Ha mintánk még „egyszerűbb”, akkor a sorba rendezést egy álló-fázissal és egy mozgó-fázissal lehet, illetve kell megpróbálni megoldani. Az ilyen módszert értelemszerűen izokratikusnak nevezzük. A lényeg azonban mindkét esetben tehát a szelektivitás. És akkor még mindig itt van a hőmérséklet!

A hőmérséklet, mint szelektáló körülmény

A kromatográfiás sorba rendezés alapja a szelektivitás, illetve a szelektivitás gyakorlati megvalósítása, kromatográfiás kivitelezés, a szelektivitás (RSi,j) megfelelő kialakítása. Ahhoz, hogy az analitikai(!) feladat – spektroszkópiai mérés/vizsgálat – megfelelő kivitelezéséhez sorrendben (lehetőleg egyenként) vehessük az említett vizsgálat tárgyává a mintakomponenseket, sorszámot kell húzatni velük, azaz a mintát „meg kell kromatografálni”. Ha ez GC alkalmazásával nem megy, mert  …, akkor először a HPLC-t kell elővenni – mint technikát –, hogy legyen szíves már megvalósítani az elképzelésünket, és sorba rendezni a mintánk, mintáink komponenseit.

Elképzelésünk mindenekelőtt a feladatról legyen, kromatográfiás nyelven. Azután jöhet az álló-fázis(oszlop), a detektor, szóval összeállhat a HPLC készülék. A következő lépés a mozgó-fázis időbeli összetételének a kialakítása, megtervezése. Amikor mindezt kipróbáltuk, és még mindig van tennivaló a szükséges szelektivitás kialakulása érdekében, akkor még mindig ott van a hőmérséklet, és ha „szerencsénk van”, a korábbi sorba rendezések során bekövetkezettnél jobb felbontást igénylő ún. „kritikus komponenspárok” szerkezeteivel, akkor a hőmérséklet-változtatás is segíthet.

Az izokratikus körülmények között a retenció és a mozgó-fázis szervesoldószer-tartalma között, a lineáris oldószer erősségi (LSS) modell alapján, a összefüggés következőképpen létezik (45.11):

log k’=log k0’ – S(B%) (45.11)

Ebben a lineáris összefüggésben a k’ az adott komponens kapacitási faktora (k’=(tR – t0/t0) B% szerves tartalmú mozgó-fázis esetén, k0 ugyanez 100% vizes eluensre, természetesen 0-ra extrapolált értékként, S pedig a lineáris összefüggés iránytangense. Amennyiben a különböző komponensek különböző meredekségű log k’=f(B%) egyenessel rendelkeznek, akkor a szelektivitás az éppen B szerepében lévő szerves oldószer %-ának a grafikon szerinti változtatásával módosítható. Természetesen amennyiben ez a „nem párhuzamosság” nem egyszerűen összetartást jelent, hanem egy konkrét B% tartományon belüli metszéspont létezését, akkor a mozgó-fázis szerves tartalmának a változtatásával sorrendet is változtathatunk a kromatogramon. A metszésponthoz tartozó B%-nál természetesen a szelektivitás nulla. Az összetartás egyébként a komponensek (45.11) szerinti egyenesei között akkor létezik tehát egy minta komponensei között, ha a szerkezetük hasonló, de legalább a funkciós csoportokban nem különböznek. Az ilyen mintákat egyébként reguláris mintáknak nevezték el. Biztosan reguláris mintát alkotnak például a homológ vegyületek. Az egyenesek egyébként egy olyan szerves tartalomhoz tartanak össze, amely elég erős mozgó-fázist alkot (általában a vízzel), és egyben képes a komponensek szelekciója nélkül „lesöpörni” a mintát az oszlopról.

Amikor a komponensek közül legalább kettőnek is olyan LSS egyenesei vannak – mint amiről elsőként tettünk említést –, amelyek nem egyszerűen összetartanak valahová, de egy „konkrét” B%-nál metszik egymást, akkor a minta ún. irreguláris minta. Egy irreguláris minta esetében az adott minta komponenseinek (példánkban az említett kettőnek) a sorrendje, az adott szerves oldószer mennyiségének (%-nak) a változtatásával megfordítható. Amennyiben „szerencsénk van” és a minta irregularitása a „kritikus komponenspár”-tól vagy komponenspároktól van, akkor valamennyire jó helyzetben vagyunk, amikor optimálnunk kell az oldószer összetételre a módszerünket. Kritikus komponenspár egyébként az a két vegyület, amelyre az adott rendszernek (álló-, mozgó-fázis) a legrosszabb. Ilyen persze mindig van, de „szerencsére” az RSi,j értéke nem mindig kritikus. És akkor jöjjön a hőmérséklet!

Az előbbiek azért kerültek – ismételten – említésre, mert a hőmérséklet változtatása alapvetően analóg az oldószerek változtatásával.

Egy mintakomponens retenciója a minta izokratikus sorba rendezése során a hőmérséklettől a (45.12) szerint függ.

log kT’=A+B/T (45.12)

A (45.12)-ben k’ – mint korábban is – a komponens kapacitási faktora, T hőmérsékleten, A és B pedig az egyenlet koefficiensei. Amennyiben a (45.12) komponensenként hasonlóan különböznek az iránytangensükben, mint azt a log k’=f(B%) egyenesek esetében említettük, és metszik egymást, akkor egyrészt megint lesz olyan – ezúttal hőmérséklet – érték, amelynél az adott komponenspárra a szelektivitás nulla, és amely hőmérsékleti érték két oldalán a retenció – legalábbis az adott komponenspárra – megfordul.

A hőmérséklet-változás – amint azt a 45.2 ábrán jeleztük – ezen hatása termodinamikai. Ez a hatás tehát változtathat a sorba rendezés korábban (szobahőmérsékleten) kialakult sorrendjén. Miután termodinamikai hatásról van szó, közelítsük a jelenséget a termodinamikából kiindulva.

A kromatográfiás folyamatok termodinamikai vizsgálatához van’t Hoff nevéről elnevezett összefüggésből kell kiindulni. A van’t Hoff-kifejezés kromatográfiás alakja a következő (45.13).

ln k’=(-ΔHo/RT)+( ΔSo/R)+ln Φ (45.13)

ahol k’ ismét csak a kapacitási faktor, ΔHo és ΔSo az adott komponensnek a mozgó-fázisból az álló-fázisba történő fázisátmenetének a normál entalpiaváltozása, illetve normál entrópiaváltozása. A Φ az álló és mozgó-fázis térfogati viszonya az adott kromatográfiás oszlopban, vagy egyszerűen csak a fázisarány. A (45.13) tehát a kromatográfia van’t Hoff- összefüggése, amely a fázisátmenet szabadenergia változásából (45.14 a,b) vezethető le.

ΔGo=ΔHo -TΔSo (45.14 a)
és
ΔGo= -RTlnK (45.14 b)

Az ln k’ az 1/T függvényében egyenes, vagy egyenessel közelíthető (45.12). Ez így inkább szűk hőmérséklet-tartományra igaz, de szélesebbre általában nem. A kromatográfiás fázisok egyébként különböző intermolekuláris kötések kialakulásával/kialakításával és megszüntetésével/megszűnésével vesznek részt a folyamatos (ide-oda)

fázisátmenetekben. Ami tulajdonképpen a kromatográfiás folyamat. Egy minta valamennyi komponensének a kromatográfiás mozgásáért a folyadékkromatográfiában ezek az intermolekuláris erők a felelősek, hasonlóan, ahogy ezek az erők az oldás, illetve elegyedés során működnek. A minta minden komponensének oldódnia kell a mozgó-fázisban. Ha az injektálás után egy komponens t0 idő alatt elhagyja az oszlopot, akkor semmilyen intermolekuláris kötés nem alakult ki közötte és az álló-fázis között. De ha egy anyag nem t0 ideig tartózkodik az oszlopban, akkor az álló-fázison is kell tartózkodnia valamennyit. A kialakult intermolekuláris erők milyensége a szelektivitásért, az erősségük pedig a retenciókért lehetnek felelősek komponensenként.

A dolog azonban eredendően nem ennyire „szimpla ügy”, már csak azért sem, mert a két fázis „verseng” az injektált minta komponenseiért. Győztes persze nincs ebben a kromatográfiás versengésben. Amennyiben egy mintakomponens esetében a mozgó-fázis az erősebb, úgy ez a mintakomponens „lerohan” az oszlopról, ellenkező esetben pedig „lecammog”, ha egyáltalán lejön. Ebben a hármas „fizikai-kémiai játszadozásban” a két fázis és a minta komponensei vesznek részt. Azt, hogy hármas játék a folyadékkromatográfiában nem négyes vagy ötös, azt csak azért nem mondjuk, mert a komponensek közötti „játszadozás” létezését nem vesszük figyelembe. De ez – nem is kevés esetben – tényleg csupán túlegyszerűsítése a helyzetnek. (Például a fehérjék analitikájában.) Persze, ha valamilyen jelenség megmagyarázásához az elmélet egyszerűsített változata is elegendő, akkor sohasem szabad bonyolítani!

Ismételten hangsúlyozni kell – mintegy összefoglalva az előbbieket –, hogy egy vegyület folyadékkromatográfiás viselkedéséért azok az erők felelősek, amelyek a sorba rendezés során kialakulnak a vegyület és a fázisok között. Ezekért az adott vegyület szerkezete, mindenekelőtt funkciós csoportjai, valamint a két fázis milyensége, elsősorban – de nem kizárólag – funkciós csoportjai tehetők felelőssé. Hozzá kell tenni azonban, hogy a fázisok nem az injektáláskor találkoznak először egymással, vagyis egy minta sorba rendezésében részt vevő fázisok a kromatografálás során már egymás „befolyása” alatt vannak. A hőmérsékletnek akkor lehet hatása egy vizsgált minta komponenseinek a sorrendjére, ha azok különböző, és inkább poláris, másodlagos kölcsönhatásokkal, intermolekuláris erőkkel kapcsolódnak a fázisokhoz. Apoláris fázisok – mint amilyenek például a C4, C8, C18 funkciós csoporttal rendelkezők – diszperziós kölcsönhatásaira a hőmérséklet-változás lényegesen kevésbé hat, mint az egyéb polárisabb kölcsönhatásokra. Nem véletlen, hogy a hőmérséklet hatása azoknak a mozgó-fázisoknak az alkalmazása esetén kifejezőbb, amelyeknek több a víztartalma. Érdekességként meg kell jegyezni, hogy noha a hőmérséklet-emelés – ha nem egyenlő mértékben, de – csökkenti a kötések erősségét, így a másodlagos intermolekuláris kötéseket, kapcsolatokat is. Gondoljunk csak az olvadás vagy a forrás jelenségére. A hőmérséklet-emelés mégis minden(!) esetben csökkenti a komponensek retencióját, vagyis okozza a mozgó-fázis erősödését. És sohasem fordítva. Ez valószínűleg csak úgy következhet be, hogy a mintakomponens-álló-fázis kapcsolatok a hőmérsékletemeléssel jobban csökkennek, mint a mintakomponens–mozgó-fázis kapcsolatok.

„Szerencsére” vannak esetek, amikor az említett kapcsolatok nemcsak erősségükben, de típusukban is különböznek mintakomponensenként. De legalább – és ez a legszerencsésebb eset – a már korábban említett kritikus komponenspárok között ez történik. Így aztán a sorba rendezés szelektivitását az oszlophőmérséklet változtatásával is(!) befolyásolhatjuk, valamelyest hasonlóan, mint az oldószer-összetétellel tehetjük azt. A (45.13) alatti van’t Hoff-függvény alapvetően lineáris, és az egyes mintakomponensek esetében lehet összetartóan „kicsit nem párhuzamos”, amikor az adott minta – hasonlóan az log k’-(B%) hasonló esetéhez – a reguláris elnevezéssel jellemezhető. Amennyiben a komponensek van’t Hoff-egyenesei közül legalább kettő metszi egymást, a minta irreguláris. Ilyen esetben a hőmérséklet változtatása az adott két komponens esetében sorrendváltozást okoz. A baj csak az, hogy a van’t Hoff-görbék még szűk hőmérséklet-tartományon se mindig egyenesek, de széles tartományon végképpen ritkán. A van’t Hoff-függvény azon a hőmérséklet-tartományon lineáris, ahol az összefüggésben szereplő ΔHo és DSo értékek állandóak, vagyis hőmérséklet-függetlenek. Amennyiben nem azok, akkor a van’t Hoff-függvény nem lineáris, hanem bizonyos hőmérséklet-értékeket is tartalmazó összetett kifejezés.

Az, hogy hőmérséklettel lehet-e változtatni adott komponenspár kromatográfiás sorrendjén, az megint „csak” az adott komponensek szerkezetétől, és persze ennek megfelelően az álló- és mozgó-fázis megválasztásától függ. A modern folyadékkromatográfiás gyakorlatban egy sorbarendezési módszer kidolgozása adott álló-fázis esetén, a mozgó-fázis és a hőmérséklet kombinált kiválasztásával történhet, a (45.12) és a (45.13) összefüggések alapján, általában négy próbakromatogramból levonható következtetések szerint.

Álló-fázis
Nyilván nem érdektelen az előzőekben ismertetett téma a hőmérséklet-változtatás kromatográfiás lehetőségeiről, de mindez elméleti – elsősorban fizikai-kémiai – fejtegetés maradna, ha mindezt a megvalósítás lehetőségeinek említésével nem tennénk teljessé, azaz szellemünk nem kóborolna vissza a napi valóság területére. Ugyanis az egész eddigi vizsgálódásunk nem érne többet egy – elméletileg megalapozott – tudományos álmodozásnál, ha a felfűtött mozgó-fázisokhoz nem lennének hőstabil álló-fázisok, vagyis a folyadékkromatográfia a gyakorlatban képtelen lenne „utánozni” a gázkromatográfiát. De képes. Mára mindenképpen. Pedig ez nem kevesebbet jelent, mint azt, hogy a forró – de mindenképpen kémiailag inert – vivőgázok helyett forró oldószerek alkotta mozgó-fázissal szemben kell álló-fázist „kiállítani” a folyadékkromatográfia „csataterére”. Tehát egy olyan fázissal szemben, amely minden, csak nem inert, főleg ha vízről van szó forrón, aminek az eddigi negatív hatásáról talán a farkasok mesélhetnének a legtöbbet. De ha eltekintünk a részletesebb „malackodástól”, akkor is nyilvánvaló, hogy a forró víz különösen szélsőséges pH-n igencsak veszélyes a védtelen álló-fázissal szemben.

A víz egyébként „szerencsére” még forrón sem csupán veszélyes, de nagyon érdekes és főleg környezetbarát oldószer. Igazán „megér még egy misét”. Ezért a vízre nemcsak ivás okán fogunk visszatérni, hanem a kromatográfiában betöltött szerepe kapcsán is. Visszatérve a hőstabil álló-fázisok ismertetésére, itt és most minden mellébeszélés nélkül be kell vallani, hogy a szilikaalapú álló-fázisok bizony nem igazán hőstabilak. Legalábbis a ma már tradicionálisnak tekinthető változatai. Ez szerencsére nem azt jelenti, hogy használatukról az emelt hőmérsékletű folyadékkromatográfiában eleve le kell mondani. Azt azonban feltétlenül, hogy mint ahogy „a mosónők korán halnak”, a szilikafázisoktól is korán el kell búcsúzni, ha rendszeresen sütögetjük őket jó vizes eluensben. Viszont ennek ellenére annyira a napi gyakorlat részesei lettek már, hogy amíg a működőképességük megfelelő, addig igyekszünk használni őket. Egy álló-fázis stabilitását a mozgó-fázis, és az extra kromatográfiás körülményekkel szemben azzal az oszloptérfogattal szokás jellemezni, amely anélkül áramoltatható át az oszlopon, hogy a teszt kromatogram különösen elromlott volna.

Ebből a szempontból a szilika alapú álló-fázisok végül is nem teljesen használhatatlanok emelt hőmérsékleten, de tényleg magas hőmérsékleten (t≥80 °C) nem sokáig. Tekintettel arra, hogy a szilika mégiscsak a legjobb álló-fázis a mai napig, elindultak azok a kutatások, amelyek az eddiginél hőstabilabb szilikagél előállítását vizsgálták. Mára a 100%-os vizet – mint mozgó-fázist – működőképesen – de szobahőmérsékleten – elviselő fázisok analógiájára, szinten szerves csoportokat tartalmazó szilikafázisok gyártását találták ki. Ezek a poli(metiloktilsziloxán) és poli(metiloktadecilsziloxán) fázisok. Remélhető, hogy a hőstabil szilikafázisok fejlesztése – a szilika különlegesen jó kromatográfiás tulajdonságainak az okán – ezen a ponton nem fog megállni.

Bármennyire is kitüntetett szerepet tulajdonítunk a szilikának – mint az álló-fázis alapanyagának – a kromatográfiában, a fejlesztés egyik területe – függetlenül az emelt hőmérsékletű folyadékkromatográfiától – új anyagok álló-fázisként való alkalmazása, illetve a régiek „rehabilitálása”. Az előbbire zirkoniumalapú fázisok, az utóbbira a különböző fémoxidok, mint TiO2 és az Al2O3 stb. és valamennyire mégiscsak a szén a legismertebb példa. Bár ez a szén a mai formájában nem igazán emlékeztet a klasszikus „szénporra”. A HPLC legnagyobb „szerencséjére”! A zirkoniumalapú fázisok egyébként akár 200 °C-on is működtethetők. Jelenleg a legnépszerűbb zirkoniumalapú folyadékkromatográfiás álló-fázis a polibutadién borított zirkonium.

A különböző műanyagalapú fázisok már korábban is szereplői voltak a magas hőmérsékletű folyadékkromatográfiának, amennyiben a gél- és ionkromatográfia álló-fázisaiként használtuk és használjuk őket ma is. A terhelhetőségük gyenge volta miatt azonban általános népszerűségük növekedése a majdnem kiváló pH-stabilitásuk ellenére sem várható.

Szót kell még ejteni a nem szemcsejellegű fázisokról, a szilika- és műanyagalapú monolit fázisokról, amiknek hirtelen jött – de nem ok nélküli – népszerűségét, mely a gyors kromatográfia területén való alkalmazhatóságuk miatt alakult ki, nem követte a gyártás fejlődése. Ez pedig szükséges lenne ahhoz, hogy olyan reprodukálható oszlopok jelenjenek meg a piacon, amikre a kromatográfiának ma szüksége van. Ez a kérdés egyébként általában még mindig jelentkezhet, sajnos. Szinte „örökzöld” felvetéseként a kromatográfiának.

Amikor a magas hőmérsékletű folyadékkromatográfia álló-fázisairól beszélünk, akkor nemcsak az álló-fázis anyagáról kell értekezni, de a kromatográfiás oszlop alakjáról is. Ahogy ez a gázkromatográfiában is történt fejlődése során. A gyors folyadékkromatográfia kialakulásával nemcsak a rövid, kis szemcseméretű oszlopok jelentek meg a kromatográfiában, de a különböző, a korábbinál lényegesen kisebb belső átmérőjű oszlopok is. Miután, közben a HPLC készülékekben az oszlopon kívüli ún. extra térfogatokat és a detektor cellatérfogatát is lecsökkentették, tulajdonképpen megteremtődött a lehetőség arra, hogy következő lépésként a töltött kapilláris és nyitott csövű kapilláris típusú oszlopokat bevezethessük a folyadékkromatográfiába is. Az SFC kapilláris változatának oszlopai nagy segítségre lehetnek a fejlődésben. Mert ez a terület még igencsak gyerekcipőben jár. De már jár! Az emelt hőmérsékletű folyadékkromatográfia egyik legnagyobb problémája – a minta és az álló-fázis hőstabilitása mellett – az oszlop termikus homogenitásában van. A klasszikus 4,6 mm-es oszlop teljes keresztmetszetében való termosztálása igencsak lassú folyamat még akkor is, ha a hosszanti hőmérséklet gradiens elkerülése érdekében a mozgó-fázist feltétlenül előtermosztálni kell, a sávszélesedés elkerüléséért. A vastagabb belső átmérőjű oszlopban azonban sugárirányú hőmérséklet gradiens így is kialakul(hat). A megoldás – mint a kapilláris elektroforézis esetében – minél szűkebb, vagyis lehetőleg valamilyen kapilláris alkalmazása (lásd gázkromatográfia!). A kapilláris oszlopok folyadékkromatográfiás bevezetése egyébként nemcsak az emelt szintű kromatográfiát tenné minél jobban lehetővé, de a programozott hőmérsékletű HPLC-t is. Gondoljunk csak a hátul cammogó kromatográfiás csúcsra, még inkább, ha az csak „csúcsocska” de mégiscsak létező mintakomponens. Vagy az oszlopon felgyülemlett koszokra.

A gyors kromatográfia említésével kezdtük mostani elmélkedésünket, ezt a magas hőmérsékletű folyadékkromatográfiával folytattuk, végezetül néhány megjegyzés:
• Bár a gyors folyadékkromatográfia olykor több mint 1000 bar túlnyomást is igényelhet, a sorba rendezés nyomásfüggése mégsem téma, egyelőre.
• A kereskedelemben már forgalmazás tárgyát képezi több gyors, vagyis az eddigieknél nagyobb nyomáson is üzemelő HPLC készülék.
Engedtessék meg, hogy kapásból – a készülék pontos neve nélkül – az ismertebb gyártókat felsoroljuk. Agilent, Jasco, Shimadzu, Thermo, Waters, így abc sorrendben, a teljesség legkisebb igénye nélkül.
• A Labinfó következő számában igyekezni fogunk egy részletes ismertetést adni a gyors folyadékkromatográfia jelenlegi piaci helyzetéről!
Az előzőek a jubileumi 10. Labortechnika Kiállítás tiszteletére (is) íródtak!

(Folytatjuk)
Pásztor József

Regisztráció
HÍRLEVÉL REGISZTRÁCIÓ
Keresés
Mit:
Hol:
gyogyszercimke Chemgeneration