Bemutatkozás/Labinformálódás/Kromatográfia sorozat 43. rész



Minta-előkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC), 43. rész: „Amíg egy minta eljut odáig”.

Sorozatunk mostani alcíme a kromatográfia egyik kiváló hazai művelőjétől, a ma már nyugdíjaséveit élő, korábban „Micu” néven közismert analitikustól, Vajda Miklós doktortól való idézet, amely korábban egy kromatográfiás előadásának a címe volt. Ez az előadás egy hazai kongresszuson hangzott el, és a minta-előkészítésről szólt. Kromatográfiás sorozatunk jelen folytatásának is ez lesz a témája, ismételten ez. Ismételten, de nem ismétlésként. Persze, lesznek állítások, amelyek már elhangozhattak, de az esetleges ismétlésükkel a fontosságukat kívánjuk kifejezni. Az olvasónak pedig nem szabad elfelejtenie – főleg ennyire a főcím közelében –, hogy sorozatunk a maga egészében a minta-előkészítésről szól, tekintettel arra, hogy koncepciónk szerint – mint azt már többször említettük – a kromatográfiai elválasztást is annak tekintjük. Eszerint egy analitikai minta konkrét vizsgálatának azt a majdnem kizárólag egy spektroszkópiai vagy elektrokémiai eljárást kell tekinteni, amely az elválasztás folyamata utáni állapotokat hivatott mérni. Hogy ez most már évtizedek óta a kromatográfia részét képezi, az csupán – és egyre inkább – a műszeripar megfelelő fejlettségi fokának köszönhető, de elméletileg nem változtat azon a tényen, hogy a kromatográfia elválasztási folyamata, „csupán” segítsége az előbb említett analitikák (spektroszkópia, elektrokémia) valamilyen változatának. Ezt azután – most már a kromatográfia részeként – a teljes kromatográfiás folyamat detektálásának nevezzük. Függetlenül attól, hogy az elválasztást és az ezt követő mérés(ek)et közvetlen, vagyis on-line, vagy közvetett, vagyis off-line kapcsolatban végezzük el. Az előbbi az analitikai kromatográfiát, míg az utóbbi – bizonyos, elsősorban komplikált esetekben – a preparatív kromatográfiát jellemezheti. Ahogy azt korábban már többször is hangsúlyoztuk, amint a kromatográfia kétféle koncepciójáról tettünk említést.

A minta-előkészítés egyébként nem tekinthető az analitikusok modern „hobbijának”. Ez a képzet egyesekben a terület mai technikai lehetőségei miatt alakulhat ki. A minta-előkészítés valójában szinte egyidős azzal az egyre inkább tudományos kíváncsisággal, amellyel a körülöttünk lévő világ kémiai összetételét igyekszünk megállapítani. Legyen elég és szabad egy – neve elhallgatását egyáltalán nem kérő – francia tudósnak, az 1743-ban született francia kémikusnak, Antoine Laurent Lavoisier nevének és munkásságának az említése. Ő rá ma mint a tudományos kémia egyik megalapítójára tekinthetünk. A tizennyolcadik század a légnemű úgymond „pneumatikus” kémia virágkora volt. Ennek megfelelően a legkézenfekvőbb ilyen halmazállapotú anyag, a levegő volt az érdeklődés középpontjában. Ugyanakkor évszázadokon keresztül a kémiai átalakulások legfőbb eszköze a hő volt, a pneumatikus kémia pedig az égés megértése volt. Lavoisier mindenekelőtt az égési folyamatok vizsgálatával és egyúttal az oxidáció jelenségével foglalkozott. Ennek során egy új és helyes magyarázatát adta az oxidáció kémiájának, megcáfolva ezzel az azokban az időkben még érvényesnek tekintett ún. phlogiszton-elméletet. Lavoisier oxidációs elméletének megszületése előtt a kor vegyészei az égő anyagból felszabaduló terméket, a phlogistont tekintették a folyamat princípiumának. 1773 és 1777 között Lavoisier – többek között – a levegő összetételét kívánta meghatározni. Ehhez a mintát a konkrét vizsgálatok előtt, annak – akkori – kivitelezhetősége céljából oxidációnak vetette alá. Ezzel gyakorlatilag mintaelőkészítést végzett. Lavoisier-t egyébként az anyagmegmaradás törvényének az egyik felfedezőjeként is tekinthetjük. A királyság idején adóbérlő volt, ezért a francia forradalom alatt halálra ítélték, és 1794-ben, 51 éves korában lefejezték. Az egyenlőség, a barátság és a testvériség jegyében!

Egy teljes analitikai módszer általános folyamatábráját a 43.1 ábrán vázoltuk fel. Minden analitikai módszer kialakítása, azoknak az információknak az összegyűjtésével kezdődik, amelyekre szükségünk van a módszer kidolgozásához. Ez akár a kollégánk telefonszáma is lehet, bár ez elég indirekten lehet szükséges. A közvetlenül szükségesek nélkül viszont elég nehéz hiba nélkül végrehajtani a megoldást. Mindenekelőtt a feladat pontos és egyértelmű megfogalmazására van szükségünk. Ezt a feladat fő- és melléktárgyának és a pontos elvi és gyakorlati definíciójának igénye követi. Ez alatt a feladatban szereplő kiindulási, közbülső és keletkezett anyagok fizikai-kémiai tulajdonságait kell érteni. Különösen reakciókövetés esetén igaz ez így. A szükséges ismeretanyagot az ábrán „bemenő információ(k)nak” neveztük el. Hozzá kell tenni azonban azt, hogy egy feladat tárgyának pontos leírása, összetételének a pontos ismerete nem minden esetben állhat rendelkezésünkre, hiszen éppen ennek a megismerése a feladatunk. Az analitikai mérés eredményének az összessége az ábrán a „kimenő információ(k)” elnevezést kapta. Az eredmény(ek) a kettő megfelelő összevetéséből alakul(nak) ki. Persze van, amikor a következtetések nem azonnal, vagyis az első analitikai mérés feldolgozásával létrehozhatók. Ezt a helyzetet a 43.1 ábrán az „analitikai akció” ciklikusságával igyekeztük jellemezni, illetve ábrázolni.

43.1fig
43.1 ábra

Az „analitikai folyamat” tartalmazza a mintavételezésből kiindulva a mérésig mindazokat a lépéseket, amelyeket e két lépés között kell megtenni, hogy az utóbbival – megfelelő következtetés, illetve következtetések levonását végezhessük el. Ezek mindazok a lépések, amelyek során az analitikai mintából vizsgálati vagy gyakorlatiasabb megnevezéssel mérhető mintát alakíthatunk ki. Ezt természetesen úgy kell tenni, hogy az így kapott következtetés(ek) az eredeti mintára, vagyis analitikai feladat eredeti tárgyára is reprezentatív(ok) legyen(ek).

43.2fig
43.2 ábra

Egy vizsgálati minta eredendően több komponenst tartalmaz(hat). Ezeket a komponenseket az analitikai feladat szempontjából kétféle csoportba sorolhatjuk. Aszerint, hogy egy komponens a vizsgálati mintában a mérés tárgyát képezi vagy sem, kétféle lehet, úgymint analizálandó komponens vagy nem analizálandó komponens, azaz a mátrix komponens. Egy minta mátrixa tehát azon mintakomponensek összessége, amely eredendően a vizsgálati minta része, de a mérendő komponensek közé nem tartozik. Egy konkrét vizsgálati minta esetében mi tartozik a mérendő, illetve nem mérendő, vagyis mátrix komponensek közé, azt az adott analitikai feladat megfogalmazása alapján dönthetjük el. Ha eldönthetjük, mert teljesen ismeretlen minta esetén erre – első közelítésben – egy analitikusnak nincs módja. Hangsúlyozni szükséges azonban, hogy az ilyen analitikai feladatok esetében is ez csak első közelítésben van így.

Egy analitikai minta esetében tehát a feladat megfelelő teljesítését két probléma zavarhatja, így ezek kiküszöbölését kell végrehajtani. A feladat megoldási folyamatának eredményt produkáló része pedig, végül is – bármilyen összetett a vizsgálati minta – valamilyen mérés. A mérendő komponensek szerkezetétől függően valamilyen spektroszkópiai (UV/VIS, FLU, IR, NMR, MS, CD) vagy elektrokémiai (amperometriai, coulombmetriai, konduktivitási), vagy egyéb típusú (RI, ELSD viszkozimetriás) mérést kell használnunk. A megfelelő mérési technikát az MS kivételével – mindenekelőtt a mérendő komponensek szerkezeti tulajdonságai alapján választjuk ki. Az MS használata első közelítésben nem függ a vizsgálandó anyagok szerkezetétől, ezért tekintjük azt univerzális vizsgálati módszernek, és így kromatográfiás detektornak. Ez persze ennyire nem egyszerű, de evvel a megfelelő részben, korábban már részletesen foglalkoztunk. Így itt most csak annyi megjegyzést tennénk, hogy bármennyire is univerzális az MS detektálás pl. szerkezet-izomerek felismerésére kevésbé alkalmas. További szempont a technika kiválasztásában persze annak érzékenysége és a mérés szelektív használatának a lehetősége.

A lényeg az, hogy a mérőberendezés – amit eseteinkben egy valamilyen kromatográf detektoraként fogunk majd használni – megfelelően lássa a mérendő minta komponenst vagy komponenseket. Mi zavarhatja ezt meg analitikai feladatainkban? Vagyis mitől romolhat el egy mérőberendezés (detektor) látása? Természetesen a műszaki állapotától. De ettől most tekintsünk el. Mert azt tekintsük tökéletesnek. Így azután a vizsgálati mintában kell a probléma okát keresni és megtalálni. Az okok pedig a következők lehetnek:

1. A vizsgálati minta túl összetett, és/vagy
2. a vizsgálati minta túl híg, és/vagy
3. A mérendő komponens vagy komponensek eredendően nem láthatók jól, és/vagy
4. A mérendő komponensek eredendően nincsenek a vizsgálati mintában hozzáférhető állapotban.

Ad 1. A vizsgálati minta – mint fentebb már említettük – nem csak a mérendő komponenseket tartalmazza. Ezek a vizsgálati anyag szempontjából sokszor fontos anyagok (lásd gyógyszer!) nemcsak feleslegesek lehetnek a mérés szempontjából, de zavarhatják is a mérés(eke)t. Ezektől a mátrix anyagoktól célszerű tehát a mérés előtt megszabadulni. Ezek az esetek jelentős részében a kromatográfia első lépését, a sorba rendezést is zavarják, vagy ha nem is zavarják egy ideig (bizonyos számú injektálásig), de maradandó és növekvő jelenlétükkel elkoszolják a sorba rendezés helyét, a kromatográfiás oszlopot, illetve később az egész kromatográfiás rendszert. Ezért a mátrixtól meg kell szabadulni, és a vizsgálati mintából ki kell alakítani egy analizálható mintát (43.2 ábra). A kialakítás folyamatát, lépéseinek összességét nevezzük minta-előkészítésnek. Tekintettel arra, hogy a kromatográfiás elválasztás célja eredendően az, hogy a vizsgálati mintát részekre bontva (sorba rendezve) az idő függvényében juttathassuk be a detektornak erre a célra kialakított átfolyásos mérőcellájába – mint azt a sorozatunk főcíme is jelzi –, mi a kromatográfiás oszlopban lejátszódó eseményeket is minta-előkészítésének tekintjük. Az előbbi azonban sem nem sorba rendezés, mint a kromatográfia esetében, de még – a megoldások jelentős részében – nem is hasonlít a kromatográfia egyik módszerére sem, ezért külön tárgyalást igénylő terület. Még akkor is, ha most majd éppen egy olyan módszer jelentőségét fogjuk hangsúlyozni, amely alapvetően kromatográfiás „jellegű”.

Az első számú igény a minta-előkészítésre tehát:
A vizsgálati minta tisztítása, analizálható mintává tétele.

Ad 2. A vizsgálati minta azonban nemcsak a mátrix jelenlététől használhatatlan egy detektor számára közvetlen alkalmazásra, még csak nem is a mérendő komponensek zavarják egymást, de az is probléma lehet, ha az utóbbi komponens vagy komponensek mennyisége nem éri el a detektálhatóság minimumát. Pedig számunkra még ez a mennyiség, illetve mennyiségek is fontosak, mivel az illető komponens vagy komponensek akár veszélyes – kumulálódó – mérgek, rákkeltő mikotoxinok vagy drogok, esetleg gyógyszerhatástanilag fontos lebontási termékek metabolitok stb. Módszerünk érzékenységét alapvetően kétféle módon növelhetjük, úgymint a mérőműszer (detektor) jobb elektronikájú változatának az alkalmazásával és/vagy a teljes analitikai módszer érzékenységének a javításával, vagyis a mérendő komponensek mennyiségének a növelésével. A minta-előkészítés során ebben az esetben ügyelni kell arra, hogy az analizálható mintára kapott eredményekből vissza tudjunk következtetni a vizsgálati mintára vonatkozó értékekre.

A második számú igény a minta-előkészítésre tehát:
A vizsgálati minta töményítése, analizálható mintává tétele.

Ad 3. Amennyiben a vizsgálati minta mérendő komponensei eredendően nem vagy csak gyengén észrevehetőek a detektor számára, akkor nem érünk semmit egy tiszta és megfelelő töménységű mintával sem. A mérendő komponenseket láthatóvá kell tenni. Láthatóvá akkor válik egy anyag – jelen esetben vizsgálati komponens –, ha olyan származékká alakítjuk, amely lehetőleg minél jobban befolyásolja a detektor eredeti jelét, vagyis kellő érzékenységgel detektálható. A mintakomponens ilyen célzatú minta-előkészítését származékképzésnek nevezzük. Származékot minden szelektív detektor számára készíthetünk abban az esetben, ha a célba vett anyag rendelkezik a szükséges funkcionális csoporttal vagy csoportokkal. A tömegspektrometriás detektor univerzális működésű, minden megfelelő illékonyságú anyagra „reagál” valahogy. A származékképzés technikája mégis alkalmazható, mert segítségével a vizsgálandó komponensek illékonyságát növelhetjük, vagy a fragmentációjukat befolyásolhatjuk pozitívan. A származékképzés legismertebb példáját az aminosavak szolgáltatják, amelyek – bár ma már, elektrokémiailag eredeti szerkezetükkel is láthatók – UV, VIS és FLU detektorokkal csak különböző származékaik formájában detektálhatók.

A származékképzés kivitelezése kétféleképpen, úgymint sorba rendezés előtt vagy után, ismertebben oszlop előtt vagy után végezhető el. A származékképzésről a Labinfó hasábjain e sorozat részeként és önállóan is szóltunk már.

A harmadik számú igény a minta-előkészítésre tehát:
A vizsgálati minta /komponensek/ származékképzése, analizálható mintává /komponensekké/ tétele.

Ad 4. Amikor egy vizsgálati minta mérendő komponense vagy komponensei kötött formában találhatók a mintában, akkor kötést, illetve több komponens esetén a kötéseket meg kell bontani, hogy az adott vegyületek szabaddá alakuljanak, és így vizsgálhatókká váljanak. A vitaminok, ezen belül leginkább a karotinok, találhatók kötött állapotban biológiai eredetű vizsgálati mintákban. De a gyógyszermolekulákra is jellemző, hogy a vérben fehérjéhez kötve is megtalálhatók. Így a vért jellemzi a szabad és a kötött gyógyszerforma jelenléte. Az arány az adott gyógyszer kinetikájára lehet jellemző.

A negyedik számú igény a minta-előkészítésre tehát:
A vizsgálati minta /komponensek/ hidrolízise, analizálható mintává /komponensekké/ tétele.

A vizsgálati mintától az analizálható mintáig, avagy a minta-előkészítés lehetőségei

A tudomány, és általában az életünk, vagy mondhatjuk a körülöttünk lévő világ bármely területén felvetett kémiai összetételt firtató kérdés, az analitikától valamilyen mérés vagy mérések elvégzését igényli, amelyek segítségével a felvetett kérdések megválaszolása lehetségessé válik.

A minta-előkészítés nem öncélú eljárások összessége. Mindig azt a célt szolgálják, hogy az említett kérdések bármelyikéért végzendő analitikai mérés megfelelően kivitelezhető legyen.

A felvetett kérdések megválaszolása tehát valamilyen analitikai mérést igényel. Azok a lépések, amelyeket minta-előkészítés néven foglalunk össze, és amelybe – felfogásunk szerint – az analitikai léptékű kromatográfia sorba rendező „első felét” is beleértjük, önmagában tehát valamilyen analitikai mérés nélkül sohasem elegendőek a felvetett kérdések megválaszolására.
A cél tehát minden esetben a mérés megfelelő kivitelezhetősége, ennek eléréséhez használjuk fel a minta-előkészítés valamilyen módszerét. Illetve azoknak a technikáknak az összességét, amit a mérés kivitelezéséig (a detektálásig) el kell végezni a vizsgálati mintával, hogy annak mérendő komponensei megfelelően legyenek mérhetők, minta-előkészítési technikákként foglaljuk össze. Ezen a területen minden a mérés érdekében történik. Így – mint azt korábban már, és azóta is rendszeresen említjük – a kromatográfia sorba rendező „első fele” tulajdonképpen csak azért szükséges a mérés előtt, mert általában nincs olyan mérési módszer, amely önmagában lehetővé tenné, hogy a minta mérendő komponenseit egymástól függetlenül vizsgálhatnánk. Másképpen fogalmazva, nincs egyetlen olyan mérőberendezés, amelynek különböző körülmények közötti működtetésével kizárhatnánk a minta mérendő komponenseinek egymásra gyakorolt zavaró hatását. Amikor ezt a mérési igényt felvetjük, egyetlen pillanatra sem állítjuk, hogy nincs ilyen, vagyis szelektíven működtethető mérőberendezés. Tulajdonképpen minden multidimenzionális, tehát pásztázó spektroszkópiai berendezést lehet ilyen módon is alkalmazni, hogy „csak” a tömegspektrometriás mérést (detektálás) említsük. Ráadásul a matematikai lehetőségek is, és a különböző jelfeldolgozó programok is megjelentek már az analitikusok számára (is). Mégis, napjaink analitikájának az átlagos technikai fejlettsége még mindig a kromatográfiás, vagyis a minta-előkészítés és mérés együttes használatát teszi lehetővé. És persze az átlagos tudásszint is. Ugyanakkor a minta-előkészítés esetében azért kell minél „jobban” kivitelezni, hogy egy adott mérőberendezés (detektor) által szolgáltatott információtartalom a lehetséges legnagyobb és legbiztonságosabb lehessen. Ez megfelelő méréstechnikai fejlettség esetén a mérés jel/zaj (S/N) viszonyától függ. Természetesen úgy, hogy az említett hányados minél nagyobb legyen. Amikor is a jelen a számunkra, illetve az analitikai feladat számára hasznos mérési értéket, zajon pedig a haszontalan mérési értéket kell érteni. A minta-előkészítés feladatát tehát – ezúttal egy teljes kromatográfiás rendszer szempontjából nézve azt – a következőképp foglalhatjuk össze:

A nyers, illetve vizsgálati mintából injektálásra alkalmas kromatográfiás minta kialakítása.

Ez a megállapítás tartalmazza, hogy a nyers, de még a vizsgálati minta (is) az esetek jelentős részében nemhogy analitikai mérésre, de még kromatográfiás vizsgálatra sem alkalmas. Mert:

A halmazállapot nem megfelelő
A homogenitás nem megfelelő
A koncentráció nem megfelelő
A tartalom túl összetett

A felsorolás tételenként önmagáért beszél, de egyúttal megállapítja mindazt, amit analitikai feladatunk megoldása során szinte triviálisnak veszünk, és nem tekintjük a feladat megoldásához tartozó lépésnek. Ezt elsősorban a halmazállapot kérdésére értjük. Pedig, mint azt a 43.3 ábrán igyekszünk bemutatni, a minta-előkészítésnek ez egyáltalán nem aprócska lépése. Részint, mert a nyers minta már állagát tekintve is sokféle lehet, részint pedig a velük járó problémák is, amíg a vizsgálati mintához jutunk (43.3 ábra).

43.3fig
43.3 ábra

Mindezen sokféleség ellenére a minta-előkészítésnek is megvan a maga alapsémája, amely a vizsgálati minta halmazállapotától függetlenül összességében – elsősorban didaktikai szempontokból – hasonlónak kell tekintenünk (43.4 ábra).

43.4fig
43.4 ábra

Ez persze egyáltalán nem jelenti azt, hogy az egyes lépéseken, részfeladatokon belül ugyanaz az analitikus teendője minden halmazállapot esetén. Sőt általában biztos, hogy nem. Ami biztos, az az, hogy – néhány speciális módszer kivételével – a kromatográfia számára tiszta homogén oldatot kell előállítani a nyers vett mintából. Az pedig nagyon valószínű, még eredendően folyadék halmazállapotú minta esetén is, hogy a nyers minta nem az. Hát még akkor, ha az szilárd, mint ahogy például a gyógyszer-analitikában gyakori, vagy gáz, mint a légtéri környezetvédelemben. A folyadék halmazállapotú vizsgálati anyag idevonatkozó problémáit a 43.5 ábrán foglaltuk össze. Az ábrán ismeretlen mintát feltételezve – az „egyszerűség” kedvéért – az MS detektor alkalmazását jelöltük meg kizárólag. Ez persze nem jelenti azt, hogy más detektálási módot nem tartunk esetenként megfelelőnek!

43.5_abra

43.5 ábra

A nyers, illetve a vizsgált minta tovább alakításához a zavaró szennyezések eltávolítása vagy a mérendő komponensek kinyerése szükséges Ezekhez az alapvető minta-előkészítő lépésekhez a minta mátrix (komponenseinek) és a mérendő komponensek fizikai (kémiai) tulajdonságai szolgálnak alapul. A lehetséges fizikai tulajdonságokat – amik alapján a minta komponensei, illetve a mintamátrix összességében különbözhetnek egymástól – a 43.1 táblázatban foglaltuk össze. A táblázatban minden egyes fizikai tulajdonsághoz mellékeltük azokat az elválasztástechnikai módszereket, amelyeket az adott fizikai tulajdonság alapján igényelt minta-előkészítés sikerének a reményében kiválaszthatunk.

43.1table
43.1 táblázat

A 43.1 táblázatban vastagon emeltük ki az aktuálisan tárgyalandó módszereket. Az extrakció alapvetően a minta-előkészítés egyik eminense. Ez általában egymással nem elegyedő fázisok közötti elsősorban megoszláson alapuló elválasztási módszer illetve módszerek összessége. Erről a területről – a preparatív kémiában betöltött szerepének megfelelően – a Labinfó hasábjain mát többször volt szó. Legutóbb sorozatunk 42. részében. Ebben ismételten megállapítottuk, hogy a különböző halmazállapotú extrahálószerrel, különböző halmazállapotú extrahálandó anyagon végzendő extrakciós technikák elnevezésénél kialakult összevisszaságot, a „mit mivel” elvet alkalmazó nevezéktani rendszer alkalmazásával lehet tisztázni. Ennek alapján mostani, további témánkat, az SPE-t, amely a szilárd-fázisú extrakció elnevezés angol megfelelőjének, a Solid-Phase Extraction kifejezésnek a rövidítése, például szilárd-folyadék extrakciónak kell tekinteni.

Az extrakció módszereit egyébként csoportosíthatjuk a részt vevő fázisok halmazállapota szerint. Ez mind az extraháló, mind pedig az extrahálandó közeg nézőpontjából lehetséges. Ezt korábban már megtettük. Ez egy praktikus alapon végzett csoportosítás. Most – minden további részletezés nélkül – egy inkább elvi alapokon nyugvó felsorolást mutatunk be (43.2 táblázat). A táblázatban a rövidítéseket angolul, a teljes elnevezéseket magyarul fogjuk közölni. Sajnos egyes esetekben a magyar elnevezés elég sután hangzik, mutatva szakmai nyelvezetünk gyengeségeit.

43.2table
43.2 táblázat

SPE
Ez az extrakciós módszer folyadék halmazállapotú minták, azaz oldott mintakomponensek kinyerésére alkalmazható. Az extraháló-fázis szilárd. Így az egész tulajdonképpen a folyadékkromatográfiából származtatható. Mondhatnánk, vissza, mert a klasszikus LC technikájára jobban hasonlít, mint a HPLC-re, azzal a különbséggel, hogy az kézbevehető léptékben és napjaink szilárd-fázisaival létezik. Ugyanakkor – ma már – szükség esetén robot alkalmazásával automatikusan is kivitelezhető. Kivitelezhetőségének igénye mindenekelőtt az, hogy a minta oldat formájában létezzen. Eredendően azonban sok analitikai feladat megoldásánál nem ez a kiindulási helyzet, vagyis a vizsgálati anyag állapota (43.2 ábra). Egyébként – mint fentebb már említettük – szisztematikusan kialakított elnevezéssel („mit mivel”) szilárd-folyadék extrakciónak tekinthető. Ez azért megemlítendő, mert egy folyadék komponensének vagy komponenseinek az extrakciójára még egy másik – vele nem elegyedő – folyadékot lehet alkalmazni. Ez a folyadék-folyadék extrakció. Ezt a két extraháló módszert valamennyire egymás konkurensének kell tekinteni, de az összehasonlítás a feladatok többségében a szilárd-folyadék extrakcióra kedvezőbb.

Az összehasonlítást a 43.6 ábrán felsorolt szempontok alapján tehetjük meg:

Oldószerigény
Emulzióképződés
Időigény
„Hangolhatóság”
Szelektivitás
Specifikusság
Munkaigény
Automatizálhatóság
On-lline kivitelezés lehetősége kromatográffal

43.6 ábra

A felsorolt technikai tulajdonságok azonban lényegesebb kérdések annál, mint hogy csupán a két extrakciós technika összehasonlításához szolgáljanak szempontként. Ezért az SPE áttekintő ismertetésénél is szempontként fogjuk felhasználni, ha egyeseket tulajdonképpen triviálisnak tekintünk is. Ilyen az oldószerigény és a emulzióképződés kérdése. Az előbbi, különösen az SPME, vagyis a mikro-SPE esetében teljesen nyilvánvaló. De az emulzióképződés kérdése sem igényel túl sok magyarázatot az összehasonlításban.

A szilárd-fázisú extrakció elmélete tulajdonképpen a folyadékkromatográfia megfelelő elvein alapul. Ennek megfelelően alakították ki eszközeit. Éppen ezért nem véletlen, hogy az SPE-nek létezik nagy nyomású változata (is), bár mai megvalósítása inkább kis nyomással vagy vákummal létrehozott elválasztási folyamat. Az SPE, mint elválasztási módszer alapvetően az elúciós kromatográfiás technikán alapul. Azonban több mintakomponens sorba rendezése ritkán következik be. A dolgot általában egy leegyszerűsített kromatográfiának tekinthetjük. (43.7 ábra)

A SPE technika más, mint a HPLC. Mert:

Az „oszlop” kisebb, mint a HPLC-ben – általában – szokásos.
A töltet kevesebb, mint a HPLC-ben – általában – szokásos.
A töltet nagyobb méretű, mint az a HPLC-ben szokásos.
A töltet kevésbé hatékony, mint HPLC-ben szokásos.
A töltet olcsóbb, mint az a HPLC-ben szokásos.

43.7 ábra

A 43.7 ábra tartalma alapján megmagyarázható, hogy az SPE kivitelezése során tényleg nem sorba rendezést hajtunk végre. Ezért neveztük a technikát a sorozatunk előző részében digitális kromatográfiának. Az igen vagy nem kromatográfiájának. Úgy, ahogy a kérdést is feltehetjük, miszerint: „Mondja, kedves Kovács úr, most megy vagy marad?”Ahogy általában ezt kérdezi egy analitikus egy vegyülettől, amikor SPE módszert dolgoz ki egy tölteten. A szilárd-fázisú extrakciót kivitelezhetjük „HPLC-szerűen” is, vagyis nagy nyomáson. Az azonban már inkább multidimenzionális kromatográfiás technika, az LC-LC része. Így is kell kezelni. Ma az SPE technika alatt elsősorban alacsony nyomáson végzett elválasztó módszert értünk, akár manuálisan, akár automatikusan hajtjuk azt végre. Az alábbi megállapításaink is erre vonatkoznak.

Az SPE technika folyamatának alapvetően 4 lépése van, úgymint:

1. Kondicionálás
2. Terhelés/injektálás
3. Mosás
4. Eluálás

Az 1. lépéssel aktiváljuk, vagyis extrakcióra alkalmassá tesszük a töltetet. A 2. lépés során a mintánkat a töltetre juttatjuk. A 3. lépés attól függően más célt szolgál, hogy mit kívánunk a tölteten hagyni. Ha a maradó anyag/anyagok a mérendő komponensek, akkor a mosás a mátrixnak tekintett mintakomponensektől szabadítja meg a vizsgálati mintát. Ha a mátrixot akarjuk a tölteten hagyni, akkor a mérendő komponensek lemosásával már a 3. lépésben létrehozzuk az analizálható mintát, mint eluátumot. A 4., azaz eluáló lépés ez utóbbi esetben már nem is szükséges, hiszen az SPE-cartridge úgyis eldobható, de ha nem, akkor most készül az eluátum. Esetleg frakciókra osztva. Legalábbis az SPE tradicionális változatában. A SPE technikának ugyanis a töltettől, és ezzel a szeparálás megvalósításától függően mára három változata, kivitelezési módja alakult ki.

Visszatérve az SPE technika általános lépéseire, amely mint a fenti felsorolásból látszik, négy, mint azt meg is indokoltuk. Ezek azonban összetettebb vizsgálati minták, és ezért összetettebb minta-előkészítés szükségessége esetén, a lépéseken belül is tovább oszthatók. Például nem egy ásos, és nem egy frakciószedést alkalmazunk. Ezt azonban reprodukálhatóan inkább csak egy automata alkalmazásával tehetjük meg. Az SPE módszerkidolgozás szempontjait és lépéseit a 43.8 ábrán vázoltuk fel.

43.8fig
43.8 ábra

Azokat az SPE módszereket, amelyeket nem jellemzi valamilyen „különleges” álló-fázis használata, mert a felhasznált töltetek kereskedelmi forgalomban megtalálhatóak, talán legegyszerűbb „tradicionális” módszernek, a tölteteket pedig tradicionális töltetnek, állú-fázisnak elnevezni. Ezeknek a használati sémáját a 43.9 ábrán mutatjuk be.

43.9.1fig

43.9.2fig
43.9 ábra

Amint azt a 43.2 táblázat lábjegyzetében már említettük, ma az SPE technikája a töltet, vagyis az álló-fázis szerkezetétől függően, alapvetően 4 különböző típusú, szelektivitású változatban létezik. Tulajdonképpen igaz ez a kromatográfiára is. Hogy ez az SPE esetén nyilvánvalóbb, annak jelenleg anyagi és egyáltalán nem elvi oka van. Az SPE álló-fázis mennyisége a megvalósíthatóság okán kevesebb, mint a tradicionális léptékű analitikai kromatográfiában. Ezzel tehát eredendően olcsóbb az összmennyisége. Ez aztán lehetővé teszi a kémiai módon testre/molekulára szabott/gyártott, de még a biológiailag testre/molekulára szabott/gyártott álló-fázisok megjelenését is, hogy csak a két legizgalmasabbat említsük most. Az előbbi, a MIP-fázis, vagy magyarul talán a „Maszk”-, az utóbbi pedig az Immunaffin-fázis típusa. A MIP-fázis a polimer szobrászok gyártmánya, amikor is a vizsgálandó molekulára, annak funkciós csoportjainak a segítségével és felhasználásával úgy „raknak” monomer receptorokat, hogy azt azután össze lehessen polimerizálni álló-fázissá. Ezután az eredeti molekulát az ún. templátot eltávolítják a polimerből, és kész a Maszk-, vagy angolul MIP álló-fázis. Az immunaffin-fázis a természet és az immunológusok ajándéka az analitikusoknak, miután azt az antigén-antitest reakció szelektivitásával az immunológusok produkálják, persze álló-fázissá aztán a vegyészek teszik. Az immunaffin-fázis egy valamilyen hordozóra kötött antitestek fázisa, attól függően, hogy mi(lyen) a „kihalászásra ítélt” molekula. Ezeknek a fázisoknak elsősorban a biológiai kérdések megoldásában lehet elévülhetetlen szerepük. Persze nem kizárólag. Ezek a minták elsősorban összetettségükkel foglalnak el sajátos helyet az analitikában. Ezekkel a fázisokkal úgymond „lehet halászni a zavarosban”. Aztán, hogy hol vár az analitikára egy zavaros minta... Tehát a biológia egész területén. Aztán a klinikai, élelmiszer-kémiai és környezetvédelmi analitikai területen biztosan. Persze a zavaros jelzőt nem kell szó szerint venni. Inkább csak a szólás miatt alkalmazzuk, de alapvetően az összetettséget kívántuk ezzel érzékeltetni.

A tradicionális, MIP- és immunaffin-fázis gyakorlati jellemzését a 43.3–43.5 táblázatokban foglaltuk össze.

Tradicionális SPE töltetek (szilika, polimer)
43.3table
43.3. táblázat.

MIP SPE töltetek (polimer)
43.4table
43.4. táblázat.

Immunaffin SPE töltetek
43.5table
43.5.1table
43.5. táblázat.

A fenti táblázatokból arra lehet következtetni, hogy a fázisok összefoglalása ma még nem egészen reális, mert a 43.3 táblázatban foglaltak egy alaposan kipróbált fázis „családról” szólnak. Ezért is neveztük el őket – elsősorban didaktikai okokból – tradicionálisnak. De a másik kettő?

Egyébként említést kell tenni egyrészt arról, hogy a MIP-fázis egyáltalán nem napjaink kitalálmánya. Engedtessék meg, hogy csak az ionkromatográfia úgymond nagy dobásait említsük meg példákként. Az egyik legyen a nehézfémeket tartalmazó minták kelátképzésen alapuló minta-előkészítése, a másik pedig a bromát kimutatása szulfát, karbonát és klorid mellett, amit a Dionex cég dolgozott ki automatikus megoldásra.

Ugyancsak említést érdemel az a SPE-fázis, amit korlátolt hozzáférésű – vagy ismét csak angolul RAM-fázisnak nevezett töltet. Amíg azonban az általunk tradicionálisnak elkeresztelt fázisokat az SPE technika eredendő fázisainak tekinthetjük, a HPLC-hez hasonlóan, addig a RAM-fázisok – minden hasznosságuk ellenére – a HPLC-ben is alkalmazást nyernek. Vagyis nem kizárólagos kuriózumai az SPE-nek. Vérplazmavizsgálatok közvetlen analízisére már a HPLC-ben is alkalmazták. Az alacsony nyomású SPE kivitelezés egyébként cartridgekben, szűrőkorongban, pipettahegyben és 96-os plate-ben lehetséges.

(Folytatjuk)
Pásztor József

Regisztráció
HÍRLEVÉL REGISZTRÁCIÓ
Keresés
Mit:
Hol:
gyogyszercimke Chemgeneration