Bemutatkozás/Labinformálódás/Kromatográfia sorozat 47. rész



Mintaelőkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC) 47. rész: Hát akkor most csip-egessünk!

A múlt század, vagy mondhatnánk az elmúlt évezred utolsó évtizedében az analitika technikáinak miniatürizálása meghatározó iránnyá vált a kutatásban. Ez az irány éppúgy magában foglalta az analitikai berendezések „miniatúráinak” a gyártását, előállítását, mint a lehetséges alkalmazások következetes feltérképezését. Az ipar belevonása a miniatűr analitikai berendezések gyártásába nemcsak egy új műszeres iparág kialakulását teremtette meg, de új erőt adott az említett trend fejlődésének is. Az akadémiai kutatások és az ipar együttműködése megteremtette a terület gyors terjedését a gyakorlati alkalmazások irányába.

A miniatürizálás lehetőségeinek kutatását megkönnyítették azok az igények és pozitív következmények, amelyek e területet jellemezték, és persze jellemzik ma is.

A különböző kemikáliák ipari mértékű gyártása a múlt század hetvenes éveitől kezdve szükségletté tették az analitikai kromatográfia preparatív célzatú és méretű fejlődését. Ezt a folyamatot „szerencsére” akkor sem tekinthetjük visszafejlődésnek, ha például a folyadékkromatográfia az eredeti Tswett-féle preparatív alkalmazástól jutott el az analitikai célzatú működésig. Ez az említett anal-prep átalakulási folyamat, már a HPLC technikai szintjén következett be, az elválasztást igénylő minta mennyisége okán. Ennek hajtóereje természetesen a minél tisztább termék előállításának a lehetősége volt, és persze ma is az. Ez a termék aztán lehetett egy gyártási folyamat köztes vagy végterméke.

A kromatográfia miniatürizálásának az okát se keressük másban, mint a mintamennyiség nagyságában. Csak értelemszerűen nem a hatalmas, hanem a nagyon kicsi mintamennyiségek elválasztástechnikai vizsgálatának megjelenő igényében. Ezek a kis mintamennyiségek – ha voltak is – csak egy bizonyos gyűjtési folyamat után, elfogadható mennyiségben kerülhettek kromatografálásra. Ha ez a kellő mennyiség nem volt meg, az analitikai vizsgálat „kínkeservessé” vált. Legalábbis az analitikus számára. Egyértelműen kijelenthetjük, hogy az analitikai módszerek miniatürizálásának az okát a szinte kötelező agytornán kívül a mintamennyiségek úgymond „hangyányi” voltában kereshetjük. Ezek a „hangyányi” minták azután az egyre bővülő biológiai ismereteink alapján igényelték illetve igénylik egyre inkább a megfelelő vizsgálatot. Különösen akkor, amikor a biológia, mely mint tudományterület – többek között – a genetikát, fiziológiát, patológiát is magában foglalva, molekuláris szinten (is) létezik. A molekuláris genetika, a genomika, valamint a molekuláris fehérjetan, a proteomika most már szinte folyamatosan szolgáltatja a felvetett tudományos kérdésekhez tartozó – és vizsgálatával a kérdések megválaszolását lehetővé tevő – kis mennyiségű minták sokaságát. És akkor van még metabolomika/metabonomika, meg a többi molekuláris terület a biológiában. Ezek a legjobb esetben is maximum µl mennyiségben tudnak „mintálózni”. De a toxikológia felvetései se mindig kilókban jelentkeznek, a klinikai kémia kérdéseire a választ gyakran cseppekben kell keresni. A miniatürizálás másik – talán még eredendőbb – okának a drága reagensek felhasználásának a csökkentését tekinthetjük, amelyeket elsősorban, de nem kizárólag egészségügyi labordiagnosztikai területen alkalmaznak.

Az emberiség miniatürizálása azonban nem az analitikai berendezések méreteinek csökkentésével kezdődött. Diogenes hordója ugyan nem ennek a tendenciának köszönhette létezését, de a budapesti lakótelepek kialakulása a múlt század hatvanas éveitől kezdve már bizonyos miniatürizálási koncepciót mutatnak. A dolgok azután majdnem láncreakció-szerűen következtek. Kicsi lakás, kicsi bútorok. De ha a bútorok kicsik, nem lehet a világvevő rádió sem hatalmas. De hát a belsejében annyi nagy cső van… Az elektrotechnika azonban már résen volt, és jöttek a tranzisztorok és a kisebb rádiók: a táskarádiók. Aztán még egy-két év, és a rádió olykor már a zsebünkben is elfért.

A „kulcsalkatrész” pedig a nyomtatott áramkör lett. Aztán évek múlva a tantusz is erre a sorsra jutott: ez a telefonkártya. De ma már pénzügyeink jelentős részét is kártyával intézzük. Igaz, ezt régebben is tették egyesek, el is vesztették mindenüket… A számítástechnikai ipar nyomtatott áramkörei megoldást kínáltak az analitika miniatürizálási igényeire. Megoldást a múlt század nyolcvanas éveinek „Nagyszerű elképzelés, de hogyan?” felvetésére. Ha a foto-litográfia képes volt áramköröket, kontroll elemeket készíteni elektromos áram számára, képesnek kell lennie fluidumok mozgatására szolgáló elemek, csatornák előállítására is. És ez így is lett.

A genetika tudománya nem csak izgalmas kérdéseket vet fel, de ezek megválaszolására mintát is szolgáltat az analitika számára. A baj csak az, hogy ezek a minták igencsak kicsik – mint azt már említettük – egy apró hártyásszárnyú rovart említve jelzőként. A genetika molekulái közül azonban a nukleinsavak másolhatók. Ez a PCR-technika. Ez az, amihez először alkalmazták a csipkártyatechnikát vagyis a miniatürizálást, melyet az angol Lab-on-a-chip elnevezés után angol szokás szerint a kezdőbetűkből LOC-nek kezdtek el „becézni”, és teszik ezt a mai napig is. Noha a Lab-on-a-chip kifejezés viszonylag új, a koncepció, mikrocsip-technológia alkalmazása analitikai készülékek miniatürizálására nem az. A gyökerek 1975-re vezethetők vissza. Az első kísérlet ekkor történt csiptechnológia felhasználására. Az első csiptechnológiájú mikroáramlásos készüléket aztán Andreas Manz és munkatársai fejlesztették ki az 1990-es évek elején. Ők szilikon- és üveglemezre készítettek a szokásos síktechnikával – vagyis fotolitográfiával és gravírozással – mikroáramlásos készüléket, egy új célzatú csipet, adaptálva ezzel az eljárást a mikroelektronikai iparból. Meg is alapozták ekkor, és ezzel, a mikroáramlásos készülékek kutatási területét. Ezután nemsokára a Lab-on-a-chip termékek kereskedelmi megjelenésének folyamata is beindult. A mikroáramlásos készülékek azzal a ténnyel, tulajdonsággal azonosíthatók, hogy az egy vagy több csatornájuknak a mérete legalább egy nagyságrenddel kisebb, mint 1 mm. Tipikusan azonban 50 µm körül van. A helyesen alkalmazott Lab-on-a-chip elnevezés egyébként olyan mikroáramlásos készülékeket ír le, amelynek zárt csatornái, üregei és egyéb szerkezeti elemei vannak, amelyekben a minta úgymond kezelhető. Zavaró elnevezés például olyan planáris készülék esetében, mint a DNA-array, amely többszörös individuális testpontot (helyet), lyukat tartalmaz, mikrocsatornák nélkül. De ez a helyzet a miniplatek esetében is.

A legfejlettebb mikroáramlásos technológiát a tintapatron jelenti. Nem véletlenül találta meg gyorsan a helyét/alkalmazását a DNS bevezetéshez/injektáláshoz a biocsip felszínén. A legfeljebb bankkártya nagyságú Lab-on-a-chip készülék kialakulására elsősorban a kapilláris elektroforézis, és az áramló oldatos injektálásos analízis ismertebb (?) nevén, a Flow Injection Analysis alias, FIA volt a legnagyobb hatással, igényelve leginkább a módszer miniatürizálását. Az utóbbi esetben a megvalósítás a FIA harmadik generációs technikáját jelenti. Ezzel jelentős költségmegtakarítással végezhetjük el a feladatokat anélkül, hogy a technika vesztene meglévő előnyeiből. A miniatürizált analitikai rendszerek között azonban feltétlenül említést kell tenni a potenciometrikus ionszelektív elektródok alkalmazását jelentő, valamint a kémiai/biológiai szenzorok használatát megvalósító mikrocsipek létezéséről. Mindkét említett terület különös jelentőséggel bír a klinikai és fiziológiai analitika területén. Egyébként a mikrocsip analitikai eszközök kétdimenziós planáris „berendezések”. Hordozóanyaguk leginkább szilika, üveg vagy kerámia. Az eldobható, egyszer használatos, általában klinikai célú mikrocsipek anyaga poliimid vagy poliészter. Egyébként ma a szilika a legnépszerűbb alapanyag, amelynek felületét fotolitográfiás ún. vékonyréteg-fémezés és kémiai maratás egymás utáni alkalmazásával alakítják ki. A csatornák eztán ráépítéssel (additív módon) vagy maratással készíthetők el. Az előbbi a szenzorok, az utóbbi az áramlási csatornák kialakítására alkalmas. Végül különböző maszkok ismételt alkalmazásával alakítják ki a felületet, amely a maszk milyenségétől függően különböző lehet.

A mikroáramlásos rendszerek előnyei:
Nagyon kis mintamennyiségek (nanoliter) alkalmazása,
alacsony reagensigény,
gyors analitika,
kis helyigény,
hordozhatóság,
költségtakarékos előállítás,
speciális esetekben eldobhatóság.

A mikroáramlásos rendszerek hátrányai:
Magasabb felület-térfogat arány,
alacsony detektálási érzékenység.

Példaképpen említjük a DNS szekvenálás klasszikus és mikrocsipes kivitelezésének két összehasonlítási adatát.
Klasszikus módszer:
Mintamennyiség: 10 µl
Időigény: 23,5 óra
Mikrocsip módszer:
Mintamennyiség: 300 nl
Időigény: 1 óra

A HPLC technika miniatürizálása az oszlop belső átmérőjére és a térfogati sebességre vonatkozólag egy folyamatban lévő trend, amit főleg a kis térfogatú/mennyiségű minták kezelésének az igénye indokol. Ilyen kis mennyiségű mintákat a fiziológia, a toxikológia, a klinikai kémia stb., szóval általában az élettudományok produkálnak. Kiegészítve az előbbi határmezsgyéjét jelentő gyógyszerészet kutatásaival, a kombinatorikus kémia területével. Ez utóbbi a mikroáramlásos technika kis időigényét használja ki elsősorban.

A keskeny furatú (narrow-bore) és a „klasszikus” analitikai folyadékkromatográfia 2,1 és 4,6 mm közötti belső átmérőjű oszlopokat és 3–10 µm közötti szferikus porózus (legalábbis legtöbbször) részecskék alkotta állófázis használatát, és 0,1–0,01 mg mintamennyiség bevitelét (injektálását) jelenti. Ehhez optimálisan ml/perc nagyságrendű áramlási sebességek tartoznak. A mikroLC technika irányába történő miniatürizálás 150 µm vagy annál kisebb átmérőjű oszlopot, µl/perc áramlási sebességet és 1 µg-nál kisebb mintaterhelést (injektálást) jelent. A további méretcsökkentés lenne az igazi nanoLC. (Nem úgy, mint ahogy ezt az elnevezést alkalmazzák.) Ez utóbbi elnevezésre keresztelt folyadékkromatográfiás technika működési jellemzői azután ténylegesen – ahogy az elnevezésből következik – lennének a nm nagyságrendű oszlopátmérők, nl/perc áramlási sebességek, és ng nagyságrendű mintaterhelések. Az utóbbi oszlopokat azután már inkább furatnak vagy „nanocsatornának” illene nevezni. A fenti értékeket elsősorban a méretek jellemzésére kívánjuk használni, nem konkrét értékként megemlíteni. Azonban akárhogy is tesszük ezt, már gondolatainkban is mikrocsippé miniatürizálódtunk.

A méretcsökkentés azonban a HPLC technikában is – a dolog természeténél fogva – következményekkel jár. Ezek a következők:

A. Előnyök:
1. Érzékenységnövekedés (a hígulás csökken!),
2. analízisidő-csökkenés (gyors analitika),
3. kis mennyiségű minta lehetősége 1 (sőt követelménye),
4. kis mennyiségű minta lehetősége 2 (jobb MS illeszthetőség),
5. alacsonyabb előállítási költség („tömegtermelés”),
6. alacsonyabb analízisköltség (nanomennyiségek),
7. 1x használatos elemző használatának lehetősége (eldobhatóság),
8. maximális integráltság és bankkártya méret 1 (hordozhatóság),
9. bankkártya méret 2 (gyors hőmérséklet-programozás lehetősége).
B. Hátrányok:
1. Korlátozott flexibilitás (korlátozott kereskedelmi kínálat),
2. a módszerkidolgozás lehetősége korlátozott (integrált rendszer!).

Ha az előbbi felsorolást megfelelően értékeljük, nem igazán juthatunk más következtetésre, mint arra, hogy a csip formátumú HPLC nem lebecsülendő „alkalmatosság” még akkor sem, ha egyelőre – a már létező megvalósítások ellenére is – talán még egy analitikust is némi utópisztikus hangulat lengi be a „zsebhápéelcé” kifejezés hallatán. Ezért aktuális témánk további kifejtésében gondolatainkkal Thomas Mann Chippolájához hasonlón – de csak szavakkal – igyekszünk „meggyőzni” az olvasókat a HPLC miniatürizálásának az igazáról. Még akkor is, ha persze e sorok írója is tisztában van azzal, hogy a technika ilyetén való átalakulása teljes egészében a következő évtizedekben szinte biztosan nem fog (még) végbemenni, ha egyáltalán valaha igen. Tesszük ezt pedig egyrészt annak reményében, hogy a hátralévő megállapításaink sem csak Márió nevű olvasónkra/olvasóinkra lesz pozitív hatással, másrészt viszont azt is remélve, hogy a konkrét irodalmi utalás ellenére is, olvasóink meg fogják őrizni a realitásérzéküket a HPLC technikájának jövőjét illetően.

Amikor az elválasztástechnika csipalapú megvalósításáról szólunk, akkor az ún. mikroáramlásos analitikai módszerek világában kell kalandoznunk, és – mint azt már említettük – mindenekelőtt egy nyomtató tintapatronjára kell gondolnunk, és annak szerkezetéből kiindulnunk. Miután ezt – legalább – fejben megtettük, nézzük meg milyen egyéb elválasztástechnikai módszernek van még létjogosultsága csip formában, még inkább „csip léptékben” megvalósulni, és persze megfelelően működni.

Mint azt korábban már említettük, a genomika és a proteomika tudományának kialakulásával megnőtt a kis mennyiségű minták vizsgálatának az igénye, amit korábban leginkább a klinikai kémia szolgáltatott. Az említett területek leginkább alkalmazott vizsgálati módszere a kapilláris elektroforézis (CE), a genetikában kiegészítve a PCR technikájával. A klinikai kémia pedig az – szintén említett – áramlásos injektálásos technikát a FIA-t alkalmazta nagy gyakorisággal. Három módszer, két analitikai és egy kémiai. De mind a három viszonylag kis mintamennyiségekre alkalmazva. Ezzel mintegy kínálva magukat a csipléptékű mikroáramlásos megoldás alkalmazására. Ez be is következett. Már csak azért is, mert sem a CE, sem a FIA esetében a mozgó fluidum áramlásához nem kell nagyobb nyomás, nem keletkezik nagyobb nyomásesés. A HPLC nevében benne is van, hogy nagyobb, nemritkán egészen nagy nyomás szükséges a mozgófázis mozgatásához.

Az elválasztó oszlop minden HPLC-rendszer kulcskomponense. Egy elválasztó oszlop konstruálásánál alapvető követelmény a robusztus kialakítás, mely mindenekelőtt a több száz bar nyomás elviselését jelenti, amelynek persze az állófázisra is érvényesnek (igaznak) kell lennie. A konvencionális fused-szilika kapillárisnak és az acél HPLC oszlopoknak „könnyedén” kell kibírni a nemritkán – és egyre inkább – több száz baros nyomásterhelést is. Ez a szemcseméret (állófázis) oszlophossz, a mozgófázis áramlási sebessége és viszkozitása, valamint az alkalmazott hőmérséklet függvényeként alakul ki a 47.1 szerint
keplet1

(47.1)
ahol u a mozgófázis áramlási-sebessége, L az oszlop hossza, η a mozgófázis viszkozitása, Ko az oszlop permeabilitása, dp pedig az állófázis mérete, átmérője.

A 47.1 képletben a hőmérséklet nyomást befolyásoló szerepe a mozgófázis viszkozitásán keresztül érvényesül. Vagyis η=f(T). A nyomás értékeinek a kialakulásáért az állófázis szemcsemérete a „leginkább” felelős. A csipléptékű HPLC elválasztó egysége sem nem vastag, sem nem hosszú a dolog természeténél fogva – már a rendelkezésre álló hely miatt is kis szemcseméretet kell alkalmazni.
A kialakuló nyomás az u-tól és az L-től a csiptechnikában nem lesz túl nagy. A kis dp-től azonban igen. Próbálni kell tehát a Ko értékét eredendően nagynak „csinálni”. Ez nagy áthatolóképességű töltött oszlopot, azaz csiptechnika esetén jól töltött csatornákat kell, hogy jelentsen.

Következmények:
legyen monolit típusú a töltet és
emelt a hőmérséklet.

A korábban említett mikroáramlásos technikák nem igényeltek nagyobb nyomást, mint említettük. A HPLC viszont, mint láttuk, igen. Mostanáig tehát a 70 bar értéknél nagyobb nyomásnak ellenálló „csipléptékű” HPLC oszlop vagy inkább mikroáramlású csatorna készítése nagy kihívást jelentett a gyártóknak. Különböző anyagokat és technológiákat próbáltak ki elsősorban a csipléptékű (alakú) áramlásos citometria, kapilláris elektroforézis, PCR és gázkromatográfia kialakításához az elmúlt évtizedben. Azonban a legtöbb ilyen elválasztásmódszernek a túlnyomásigénye nagyon alacsony. Normálisan az említett technikák túlnyomásigénye a 0,5 bart is alig haladja meg. Csipléptékű kialakításukhoz sem kell olyan nyomásesés, amely az ilyen irányú kutatások szélesebb elterjedését különösebben indokolta volna.

A csipalapú mikroáramlásos csatornák kialakításához különböző technológiák alakultak ki.

1. PDMS mikroáramlásos technika
A PDMS (polimetilsziloxán) mikroáramlásos csatorna az ún. „lágy kőnyomtatásos” technikával készül.

Előnyök:
Az előállítás viszonylag könnyű,
átlátszó,
biokompatibilis.

Hátrányok:
Nem igazán nyomásálló (p ≤ 2 bar),
túl lágy,
nem igazán vegyszerálló.

További technológiák
2. Termikusan kötött mikroáramlásos csatorna technológia
3. Parilén mikroáramlásos csatorna technológia
4. Süllyesztett mikroáramlásos csatorna technológia
5. Nagynyomású Parilén mikroáramlásos csatorna technológia
6. Kötött típusú Parilén mikroáramlásos csatorna technológia
7. Beágyazott típusú Parilén mikroáramlásos csatorna technológia

Eltekintve a fenti felsorolások részletesebb ismertetésétől, kijelenthetjük, hogy azok előállítása egyszerű vagy bonyolult voltukban, továbbá esetünkben a HPLC-re való alkalmasságukban illetve alkalmatlanságukban különböznek egymástól. Ez a kialakítás egyszerűségén túl a nyomás- illetve vegyszerállóságukban jelentkezik.

Említést kell azonban tennünk arról az anyagról, amit az előzőekben Parilén (Parylene) néven említettünk. A Parilén a különböző polixililén polimerek kereskedelmi elnevezése. A Parilén előállítása p-xililénből történik a dimerjén keresztül.

Tulajdonságai/jellemzői:
Hidrofób anyag,
jellemzően kiváló kémiai rezisztencia,
gázokra rossz áteresztőképesség,
kiemelkedően jó elektromos szigetelő, alacsony dielektromos állandóval,
biostabilitás, biokompatibilitás, FDA engedélyezett szerkezeti anyag,
kellően tömör,
kellően képlékeny és átlátszó borítást ad,
vákuumban szobahőmérsékleten megmunkálható,
homogén felszínt képez,
termikusan stabil 220 °C-ig,
mechanikusan stabil –200 °C és +150 °C között,
nagy elektromos ellenállás.

A Parilént a fenti tulajdonságai és jellemzői alapján használják a HPLC-re jellemző nyomás, és hőmérséklet-rezisztens csip vagyis HPLC csip előállítására. Erre a fentebb említett mikroáramlásos csatorna technológiák közül a 6. és 7. módszer, vagyis a kötött típusú Parilén-, és a beágyazott típusú Parilén mikroáramlásos csatorna technológiák alkalmasak, illetve megfelelőek.

Akármennyire is csip a csip, és akármennyire is lehet egy ruhásszekrényben is most már kromatografálni egy csipléptékű HPLC-vel, a HPLC eredeti lényege – amiért használjuk – az az elválasztás, ami a rendszer szelektivitása nélkül sem akkor nem létezik, ha a HPLC szekrénnyi méretű, sem akkor, ha gyűszűnyi.

A szelektivitás, amely tehát az elválasztás, másképpen felbontás (Rs) alapja, önmagában az álló- és a mozgófázis milyenségétől függ. Amennyiben az állófázis adott, változtatásra maradnak a mozgófázis és/vagy a körülmények. Ez a helyzet természetesen egy adott és csakis egy adott feladatra érvényes. A csipléptékű HPLC-technika sok kérdőjele közül az állófázisok korlátozott hozzáférése talán a legnagyobb.

A mozgófázis összetétele azonban nem mindig állandó egy feladat megoldása során a HPLC-ben. Mégpedig akkor nem, ha a mintakomponensek retentív tulajdonságai egy adott állandó összetételű mozgófázis alkalmazása esetén nagyon szélsőségesen különböznek egymástól. Ilyen esetben a mozgófázis összetételét „menet közben” változtatni kell. Ez a gradienselúció esete, ahogy erről már volt szó sorozatunk korábbi részeiben. Na, ez a csipléptékű HPLC esetén még nem igazán megvalósított. De a csiplépték nem csak arra jó, hogy előbb-utóbb a HPLC készüléket zsebre tehessük, de arra is, – és ez lényegesebb – hogy hőmérséklete gyorsan változhasson, ahogy a kapilláris gázkromatográfia vagy a kapilláris elektroforézis esetében ez lehetséges, és persze egyébként lényeges is. Ez viszont arra ad lehetőséget, hogy az elválasztás hőmérséklete az elválasztási folyamat során gyorsan változzon, vagyis programozható legyen.

A hőmérséklet hatását a folyadékkromatográfiában sorozatunkban már többször tárgyaltuk, éppen növekvő fontossága okán. Azt is elmondtuk, hogy bár a HPLC-ben sokáig nem tulajdonítottak jelentőséget a hőmérséklet emelésének, ellentétben a GC-vel, mára a hőmérséklet szerepét az elválasztás létrehozásában nehéz lenne tagadni. Annál is inkább, mert az mint „kiderült”, esetenként a hatás többszörös is lehet. A hőmérséklet hatása egy elválasztástechnikai folyamatra alapvetően termodinamikai és/vagy kinetikai lehet. Az előbbi hatás az elválasztandó komponensek szerkezetétől, ezek viszonyától függően alakul ki. Amikor is a komponenspár mindkét elválasztandó tagjára igaz a 47.2 összefüggés, miszerint:
keplet2

(47.2)
mint azt már több korábbi részben is vizsgáltuk. Amennyiben az elválasztandó anyagokra/komponenspárra, az ln k–1/T függvény - amennyiben lineárisan közelíthetőek  - párhuzamosak, akkor értelemszerűen a hőmérséklet-változás szelektivitásváltozást nem tud okozni. Ilyenkor az egyenesek iránytangensei a ΔHoi/R illetve a ΔHoj/R azonosak vagyis a fázisátmenetek szabad entalpiái azonosak (
ΔHoi= ΔHoj). Ilyenkor α≠f(T) vagyis a szelektivitás nem függvénye a hőmérsékletnek. Azonban, ha az említett függvények nem párhuzamosak akkor igen, mivel az adott komponenspár α-ja (ahol α=kj/ki), függvénye a hőmérsékletnek (α=f/T). Általában lineárisan, amikor egy adott hőmérsékleten α=0 is lehetséges.
A hőmérséklet a sorba rendezés kinetikai folyamatára mindig hatással van, és magasabb hőmérsékleten a kinetikai folyamat - így a sorba rendezés is - mindig gyorsabb. Különösen makromolekulák esetében, mint amilyenek például a fehérjék.

Hatással van azonban a hőmérséklet a mozgófázis erősségére, különösen amennyiben vizes eluens alkalmazásával fordított fázison választunk el. De a csipléptékű HPLC elsősorban a biológiát szolgálja ki, mint arra már fentebb hivatkoztunk. Vagyis valamilyen vizes mozgófázis alkalmazása a napi valóság része.

A víz azért komponense a fordított fázisú HPLC sorba rendezés mozgófázisának, hogy részvételi arányának megfelelő mértékben csökkentse a vele elegyedő szerves komponensek apolárosságát, vagyis a mozgófázis "erősségét", a mintakomponensek megfelelő retenciója érdekében. Ha a mozgófázis még így is túl erős, mert a minta komponensei vagy valamelyik komponense annyira hidrofil, hogy még mindig t0-val közlekednek, illetve közlekedik, akkor sokszor már csak a tiszta víz segíthet, mint mozgófázis. De sokáig ez nem volt lehetséges, mert a 100%-os vizet az a tisztán apoláris fázis nem tudta elfogadni, még nyomás hatására sem, a fázis lekonyulása, vagyis az "unalmas bemondása" nélkül. De ahogy két - nem elegyedő - folyadékfázisból tudunk egyet csinálni egy megfelelő harmadikkal, úgy (?) hoztuk össze a tiszta vizet egy hidrofób, például egy C18 állófázissal, amikor ez utóbbi fázisba valamilyen hidrofil csoportot "hímeztünk bele". Jöhet tehát a tiszta vizű mozgófázis is, ha az is elég bizonyos anyagok/mintakomponensek megfelelő retenciójához. És a többi apolárisabb mintakomponenssel mi lesz? Hát bizony észrevették a víznek azt az - régóta sejtett és egyébként nyilvánvaló - tulajdonságát, hogy a hőmérsékletének emelésével folyamatosan veszít polárosságából és magas hőmérsékleten egész jó kis apoláris oldószerré alakul. Valamennyire igaz ez a metanolra és az acetonitrilre is, ha nem is annyira átalakulva, mint a víz.

Most vegyük figyelembe, hogy a csipléptékű HPLC esetében - egy kicsit a dolog természetéből fakadóan - a mozgófázis változtatása a kromatografálás során, vagyis az úgynevezett gradiens elúció nem igazán lehetséges. Lehetséges viszont a csipléptékű HPLC hőmérsékletének a változtatása. A vízről elmondottak és az előbbi kijelentések együttes következménye tehát: a hőmérsékletben programozható HPLC megszületése.

(Folytatjuk)
Pásztor József

Regisztráció
HÍRLEVÉL REGISZTRÁCIÓ
Keresés
Mit:
Hol:
gyogyszercimke Chemgeneration