Mintaelőkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC), 46. rész: Amikor a chip, nem annyira chup!

A folyadékkromatográfia – mint már annyiszor említettük – a múlt század elején alakult ki, így a technika a jelen évtizedben átlépte a matuzsálemi 100 éves kort. Tswett a múlt század kezdetén végezte bevezető munkáit a folyadékkromatográfia felhasználásával, azaz bevezetésével kapcsolatban. A folyadékkromatográfiának ezt a kezdeti vagy inkább bevezető szakaszát a szakma mai megítélése – a maga természetességével – a terület klasszikus korszakának tekinti. Technikai szempontból ezt a korszakot gravitációs oszlopkromatográfiának tekinthetjük. Ez a technika ma is megtalálható néhány preparatív szerves laborban, majdnem eredeti formájában. Továbbfejlesztett változatában meg pláne. A klasszikus korszakra jellemző a kromatográfiás töltetek, azaz az állófázisok kezdetlegessége, legalábbis mai szemmel nézve.

Azután Kuhn és Lederer 1930-ban közleményükkel minden eddigi elért eredményre „rátettek egy lapáttal”, ezzel megerősítették a folyadékkromatográfia létét vagy mondhatjuk konkrétabban, újra bevezették a technikát. Egyébként technikai szempontból a folyadékkromatográfiát a gravitáción alapuló, kényszerítés nélküli áramlás tette az áramlásos elválasztás módszerévé. Az 1940-es éveket a „szabadáramlás a papírlapon” technika bevezetése jellemezte, fel vagy leszálló kivitelezésben. A múlt század 50-es éveit pedig az első kényszeráramlásos kromatográfiás technika, a gázkromatográfia megjelenése jellemezte. Ebben a kromatográfiás technikában gáz halmazállapotú mozgófázist alkalmaztak, illetve alkalmaznak a mintakomponensek mozgatásához. A mintának ezért hasonló halmazállapotúnak kell lennie. Ez azt jelenti, hogy a gázkromatográfia eredendően az illékony minták analitikája. Ugyanakkor ez még kizárólagos lehetőség a kényszeráramlásos technikák területén. Ezért a magas forrpontú anyagokat – esetenként nagyon is munkaigényes – származékképzéssel tették apolárisabbá, vagyis illékonyabbá. Ezeknek a főleg – de nem kizárólag – biológiai eredetű vegyületeknek a közvetlen analitikájához egy illékonyságot nem igénylő kényszeráramlásos technikára volt szükség.

Aztán újabb tíz év és a szabadáramlásos papírlapkromatográfia szabadáramlásos vékonyréteg kromatográfiává alakult, vagy inkább mondhatjuk ebben az esetben is, hogy fejlődött. A szilika, alumínium és poliamid alapú fázisok alkalmazásával a rétegkromatográfia nemcsak nevében különbözött a papír-, azaz cellulózkromatográfiától, de alkalmazási területében is. Ezen – az értelemszerűen a vékonyréteg (TLC/VRK) kromatográfia elnevezést kapó – technika alkalmazásának előnyei az eredeti papírkromatográfiával szemben akkor is nyilvánvalóak voltak, ha kezdetben a szegényebb laborokban kenni kellett a réteget, míg ugyanitt korábban egy papírvágó olló is megtette. Az említett betűk egyébként az angol, illetve magyar elnevezés rövidítései.

A vékonyréteg kromatográfia kialakulásával befejeződött a szabadáramlásos kromatográfiás technikák kialakulásának korszaka. A szakemberek az elválasztás-technikai elvek alapján igyekeztek nem egyszerűen fejleszteni a már korábban kialakult elválasztási módszereket, hanem a technikai fejlődések segítségével a gázkromatográfiához hasonlóan az említett másik két módszer (LC, TLC) esetében is célba vették azok kényszeráramlásos megoldásának a kialakítását. Ez mindkét esetben pumpa használatát igényelte a természet fizikai jelensége – a gravitáció alkalmazása – helyett. Egy pumpáét, amely az adott esetben a mozgófázist illetve esetekben egy folyadékfázist képes túlnyomással kényszeríteni, azaz átáramoltatni az állófázist alkotó szemcséken.

A szabadáramlású lemez/rétegkromatográfia megjelenése óta megint öregedtek a korszak analitikusai kb. tíz évet. Az 1960-as évek végén, a 70-es évek elején vagyunk, és a „vagányabb vezetésű” laborokban megjelennek az első generációs HPLC készülékek. Preparatív laborokban preparatív, analitikai laborokban analitikai célokra (is). A folyadékkromatográfia tehát kialakult kényszeráramlású, azaz túlnyomásos formában (is). Ezt a megvalósítást a megjelenésével egyidőben nagynyomású folyadékkromatográfiának, illetve annak angol nyelvű betűszavával HPLC-nek nevezték el. Ez aztán számos korabeli tréfás elnevezésre adott lehetőséget, mint például: a High Price Liquid Chromatography. Ennek a betűszónak azonban a High Performance Liquid Chomatography, vagyis a Nagy Hatékonyságú Folyadékkromatográfia a legjobb kibontása, mert egyrészt a kezdeti nyomások – normális esetben – nem is voltak olyan nagyok, másrészt a HPLC éppen hatékonyságában múlta, illetve múlja felül ma is az LC technikáját. Kialakulásának is ez volt az eredeti célja. A nyomás növekedése „csak” következménye (volt) ennek a célnak. Az elmélet és ezzel az analitika „szerencséje” volt, hogy a technikai megvalósítás is sikerült.

És ahogy arról sorozatunk mostani része beszámolni kíván, azóta is folyamatosan így történik. Egyébként tekintettel arra, hogy a gázfázisú elválasztástechnikának nem létezik, és a dolog természeténél fogva nem is létezhetett soha gravitációs változata, ezért aztán nincs külön GC- és HPGC technika, mint a folyadékkromatográfiában. Létezik, azaz inkább már csak létezett azonban töltött oszlopos-, és létezik ma kapilláris GC technika. Ez utóbbit azonban jó ideje nyugodtan nevezhetnénk HPGC-nek. Ez is mutatja a gáz halmazállapotú elválasztásokban az állófázis kialakításának a jelentőségét.

Mielőtt azonban a HPLC technikai fejlődésének a nagy pillanatait felidéznénk, tárgyalásunkban az elválasztástechnika egészének a modernkori fejlődésénél fogunk maradni.

Szóval, a múlt század 70-es éveiben van nekünk egy gázfázisú (GC), és egy folyadékfázisú (HPLC) elválasztástechnikai módszerünk. És ami addigra mindkét módszer jellemzője, hogy mindkettő műszeres módszer. Van ezeken kívül ekkor még egy olyan szabadáramlásos folyadékkromatográfiás technikánk is, amely – mint arra már utaltunk – kiterített állófázist használ. Ez pedig a vékonyréteg kromatográfia (TLC/VRK), a maga különböző típusú és méretű rétegeivel valamint „fürdőkádjai”-val.

A kromatográfia – legyen az akár GC, akár HPLC – teljes folyamata elválasztásból és detektálásból tevődik össze. Ezt aztán – szintén mindkét említett esetben – az értékelés követi. Ez utóbbi persze csak a teljes analitika része, a „szűken vett” kromatográfiának nem annyira. A gázfázisú elválasztások népszerűségét a detektálás kiválósága teszi azzá. A folyadékkromatográfiában viszont a mintának nem kell illékonynak lennie. De mi van akkor, ha a minta se nem illékony, se nem detektálható, amennyiben a helyzetet leegyszerűsítve jellemezzük. Szóval „valami bűzlik Dániában”. Engedtessék meg, hogy a szuperkritikus kromatográfia (SFC) megjelenésének okát most itt ennyire egyszerűen oldjuk meg. A szuperkritikus anyagi állapot, nem halmazállapot. Abból továbbra is három létezik, úgymint a szilárd-, folyadék- és gáz halmazállapot. A szuperkritikus állapot olyan állapot, amelyben karikírozva, a folyadékok gázszerűek és a gázok folyadékszerűek, vagyis az anyagok tulajdonságai a folyadék- és gáz állapotra „egyszerre” jellemzőek. Egy anyag akkor kerül ebbe az állapotba, ha hőmérséklete és nyomása egyszerre nagyobb az adott anyag ún. kritikus értékeinél (t_k, p_k). Bár a szuperkritikus állapot felismerése majd’ 200 éve történt, az SFC megjelenése csak az 1980-as évek elejére tehető. Vagyis megint kb. tíz év telt el az előző említett esemény óta. Miután sorozatunkban korábban minderről részletesebben szóltunk, engedtessék meg, hogy most itt leegyszerűsítve jellemezzük a kérdést. A helyzet ráadásul az, hogy mindez nem lenne különösen használható az elválasztástechnika számára, ha nem létezne egy CO₂ nevű anyag, amelynek az említett szuperkritikus értékei (t_k, p_k) használhatóan alacsonyak. Így aztán a szuperkritikus kromatográfia, elsősorban CO₂ mozgófázis alkalmazásával létjogosultságot nyert az elválasztástechnika területén. A CO₂ környezetszennyezést nem okozó természetes anyag, amelynek a fizikai tulajdonságai szuperkritikus állapotban a folyadék halmazállapotú hexánhoz teszik hasonlóvá. Így kromatográfiás viselkedése is ahhoz hasonló, vagyis apoláris. Ez sajnos korlátozza is a szuperkritikus CO₂ alkalmazási lehetőségeit, mivel polárisabb viselkedéshez olyan poláris szerves módosító szükséges, mint amilyen például a metanol, etanol, acetonitril. Ezek azonban amellett, hogy növelik a szuperkritikus keverék polaritását, mondjuk úgy „rontják a szuperkritikus CO₂ eredeti adatait” illetve a CO₂ jó tulajdonságait. Ez az adott keverék magasabb szuperkritikus értékeit és kevésbé környezetbarát jellegét jelenti. Ezért azután ez az elválasztástechnikai módszer ma inkább csak az extrakció, és a preparatív kromatográfia eszköztárában található.

A tudomány fejlődését az igények, másképpen mondva a megoldandó problémák, és a technika/technikák fejlődésének az egymásra hatása „katalizálja”. Az analitikáét is! Az igényeket, azaz a megoldandó feladatokat pedig egyre inkább az életszagú biológia szállította, illetve szállítja. Ebben pedig a nukleinsavak és fehérjék analízise alkotja a legnagyobb – és folyamatosan növekvő – területet. Ez pedig ionos vegyületek analitikáját jelenti. Az ionos anyagok elválasztása rétegen lévő gél alapú közegben, elektromos tér hatására történik a biokémiában hosszú évtizedek óta. Talán a kapilláris gázkromatográfia hatására, talán nem, de az 1990-es évek kezdetén a lab-gél elektroforézis mellett, annak kapilláris változata a kapilláris elektroforézis (CE) technika is kialakult, vagyis műszerezett formában lett az elválasztástechnika része. Ebben az esetben az ionos vegyületek áramlása a kapillárisban, az elektromos tér hatására – legalábbis eredetileg – az adott elválasztási feladatnak megfelelő vizes puffer oldatban és nem gélben történik. A kapilláris elektroforézis előnye az elektroforézis minden korábbi megvalósításával szemben, mindenekelőtt az automatizálhatóságában van. Az injektálás, elválasztás, detektálás és kiértékelés egymás után automatikusan elvégezhető. A technika, bár a mai napig a biokémiai analitika módszere, az előzetes várakozást nem igazán tudta beváltani, legalábbis egyelőre. Mint az az elválasztástechnikai módszer sem, amely a kapilláris elektroforézis és a HPLC közös technikájaként kapilláris elektrokromatográfia (CEC) néven került bevezetésre, talán éppen megint közel tíz év múlva, vagyis kb. az ezredfordulón.

Bármennyire is furcsa, mégis ki kell jelentenünk, hogy a kromatográfia eredeti értelmében a gázkromatográfia, és a kapilláris elektroforézis nem igazán kromatográfia, amennyiben a minta komponenseinek elválasztása nem két fázis közötti megoszlásuk különbsége okán következik be. A gázkromatográfiában azért, mert erre a gázfázis nem alkalmas (nincs oldó hatása). A kapilláris elektroforézis meg azért, mert nincs állófázis. Nos, a kapilláris elektrokromatográfiában ismét a termodinamikai megoszlás különbözősége a komponensek megoszlásának az alapja. A technikák fejlődése persze nem áll meg a megjelenésükkel. Azért az  utóbbi két módszer további fejlődése is valószínű.

A kromatográfiás technikák kronológiai sorrendben végzett felsorolásában, az 1960-as évek kezdetéhez a vékonyréteg kromatográfia (TLC) bevezetését tettük. Természetesen ezzel nem akarjuk azt mondani, hogy az a semmiből akkor keletkezett. Egy hosszabb folyamat eredményeként alakult ki az a helyzet, hogy a vékonyréteg kromatográfia eszközeinek a kínálata általánosan elfogadott analitikai technikává tette a módszert. Ahogy az a többi említett elválasztás-technikai módszer illetve általában az analitikai módszerek esetében is történt, illetve nyilván történni is fog, a jövőben is. Az analitikai módszerek fontosságuktól, és technikai lehetőségüktől függő gyorsasággal fejlődnek. Ami a lényeg, mindig legyen egy vagy több ok és cél a fejlődésre, és ehhez/ezekhez, legalább terv a hogyanra.

Ezen megállapítások után vegyük észre, hogy az előbb ismételten szóba kerülő vékonyréteg kromatográfia eddig szabadáramlásos technikaként került említésre. Pedig az elmélet és a Tyihák Ernő – Mincsovics Emil „szerzőpáros” állhatatossága a vékonyréteg kromatográfiát is a kényszeráramlásos folyadékkromatográfiák közé fejlesztette. Ez a folyamat nem volt túl gyors, és egyben megmutatta a hazai innováció és kereskedelem minden „szépségét”, de végül is, ha lehet egy ilyen folyamatnak – mint említettük – igazán vége, megjelent az a túlnyomásos vékonyréteg kamra, amely pumpájával, szelepeivel, vagyis az összes tartozékaival együtt, minden korábbi technikai próbálkozásnál alkalmasabb lett a kényszeráramlásos vékonyréteg kromatográfiás technika kivitelezésére. Kihasználva annak minden lehetséges előnyét az oszlopelrendezésű folyadékkromatográfiával szemben. Az utolsó verziójú készülék megjelenésének az időpontját talán a múlt század 90-es éveinek elejére tehetjük.

Egyetlen szóval sem szabad azt állítanunk, hogy a kényszeráramlásos vékonyréteg kromatográfia a HPLC technikájának egyenrangú konkurense, de azt igen, hogy annak megfelelő magas színvonalú kiegészítése, segédtechnikája. Mindenekelőtt, mint az „egyszerre több minta” feldolgozásának, valamint a „kifejlesztett réteg” értékelésének minden más elválasztástechnikai módszernél kötetlenebb lehetőségét szükséges megemlíteni. Amennyiben a klasszikus, vagyis a szabadáramlású vékonyréteg kromatográfiát – a többi klasszikus elválasztástechnikai módszerhez hasonlóan – lassú és kevésbé hatékony módszernek tekintjük, ami egyébként az igazság, különösen vizes rendszerekben végezve a kifejlesztést, akkor a túlnyomásos rétegkromatográfiát – a többi kényszerárammal működő „kollégájához” hasonlóan – gyors és hatékony elválasztástechnikai módszernek kell tekintenünk. Az értékelés flexibilitásának említésével annak a lépésnek a sokféleségére utaltunk, amit a rétegkromatográfiában „előhívásnak” nevezünk, és amivel lehetővé tesszük a kifejlesztett réteglap vizsgálandó foltjainak detektálását. Az érthetőség kedvéért hozzátesszük, hogy egy adott HPLC készülék használata esetén a rendelkezésre álló detektor is adott. Legalábbis a magyar valóság inkább ez, mint a detektoregység célirányosan szabad megválasztása feladatonként.

És akkor vissza a HPLC technikájához
Amint azt már a nyitó mondatunkban indításként említettük, mára a folyadékkromatográfia korát tekintve bekerült a száz évnél idősebb analitikai technikák táborába. Ez 2003-ban következett be, ugyanis amikor Michail S. Tswet orosz botanikus a klorofillnak növényi extraktumból való kinyeréséhez ezt a bizonyos – akkor – új analitikai technikát alkalmazta, 1903-at írtak. Tswet azután a technikát kromatográfia elnevezéssel publikálta. Egy összetett szóval, amely két görög szóból, a szín-ből és az írás-ból állt össze, és ilyenformán színírást kívánt jelenteni. Tette pedig ezt Tswet azért, mert színes anyagokat választott el illetve nyert ki, és ezzel mintegy – ahogy gondolta – leírta növényi mintáját (mintáit). Miután pedig ezt a kromatográfiát – legalábbis a sorbarendezést – oldószerekkel, vagyis folyadék halmazállapotú anyagokkal végezte, a színírás elnevezést az eljárás még teljesebb jellemzésére, a mozgófázis halmazállapotára utaló szóval is kiegészítette.

A folyadékkromatográfia tehát – a mai analitikai nomenklatúra szerint – szilárd-folyadék kromatográfiaként született. A növekedése során aztán szépen továbbfejődött, kibővült. Most nézzük meg, hogy mit jelent ez mára. Legalábbis próbáljuk meg.

A folyadékkromatográfia tehát szilárd-folyadék, vagy az elválasztás folyamatának mechanizmusa által elnevezve adszorpciós kromatográfiának született. A célját tekintve pedig preparatív módszernek. Ezután – ahogyan a zenetörténetben Johann Sebastian Bach munkásságával történt – Tswet korábbi invencióját is ismételni kellett. Bach esetében ezt Felix Mendelssohn tette a 19. század közepén, a kromatográfiában pedig – mint említettük már – Kuhn és Lederer, valamint a két világháború között a Pécsi Orvostudományi Egyetemen dolgozó Zechmeister. Talán még ugyanennek a korszaknak a nagy eredményeként kell foglalkozni az angol A. I. P. Martin és a skót R. L. M. Synger 1941-ben tett bejelentésével, miszerint a kromatográfiában folyadékfázis helyett gázfázist is lehetne alkalmazni. Mindezt azzal a további ötlettel is kiegészítették, hogy a szilárd állófázist folyadékkal impregnálják. Az előbbi ötlettel a gázkromatográfiát, az utóbbival – az adott esetben – a folyadék-gáz kromatográfia alapjait teremtették meg. A tudós világ nem is maradt hálátlan a két felfedezővel, és az éppen aktuális világégés befejezése után 7 évvel Martin és Synger a felfedezéseikért fizikai Nobel-díjat kaptak.

Ezzel a sikerrel a kromatográfia is szélesebb analitikai körben lett ismert, ami további fejlődésének nyilván nem ártott. A megoszláson alapuló technika a folyadékkromatográfiában egyébként a folyadék-folyadék kromatográfia. 1952-t írtunk ekkor, és egy nagyobb technikai fejlődés kezdetén volt a világ. Ez nyilvánvalóan az elválasztástechnikában is így volt, és a gázkromatográfok megjelenésével ennek az első igazi eredménye az 1960-as években meg is mutatkozott. A folyadékkromatográfia területén ez a fejlődés, ez a kifejezetten technikai fejlődés a korábban említett 10 év elteltével következett be. Ez is mutatja a két kromatográfiás technika, vagy inkább a gáz, és a folyadék halmazállapot tulajdonságai közötti különbséget. Ez a különbség egyébként a mozgófázis áramoltatása, és a vizsgálandó vegyületek detektálásának a kivitelezhetősége között a legjellegzetesebb. Ezek a mai napig is léteznek még akkor is, ha ez utóbbi, a HPLC technika esetében is nagyot fejlődött.

Visszatekintésünkben azonban kronológiailag még nincs HPLC megalkotva. Van C. J. Giddings Salt Lake City állami egyeteméről és egyre szélesebb/nagyobb az elméleti késztetés a HPLC technikai megvalósítására, de nincs még készülék a kereskedelemben, az okos gondolatok, elméleti ismeretek alkalmazására. Aztán ahogy korábban is történt az emberiséggel, a HPLC készülék berobbant az analitikai műszerek piacára és helyet követelt magának valahol a gázkromatográf mellett. A gázkromatográfusok egyszerre konkurenciát és segítséget kaptak. A HPLC megjelenése azért mind elvileg mind pedig gyakorlatilag segítség volt a gázkromatográfusoknak azzal, hogy létezésével szép folyamatosan megszüntette azoknak a vegyülettípusoknak a gázkromatográfiáját, amit – magasabb forrpontjuk miatt – csak származékolt formában lehetett gázfázisban kromatografálni. Ilyenek – többek között – a cukrok, savak, prosztaglandinok, illetve úgy általában a biológiai eredetű anyagok voltak.

Megjelent tehát – elsősorban a „vagány” laborokban – a HPLC technika. Nag, robosztus készülékként, mint amilyen a DuPont-é és a Varian-é, valamint a Puy Unicam-é volt. Ahol kellett preparáltak vele, ahol analitikára volt szükség, ott arra próbálták használni őket. Próbálták, mert nem mindig sikerült. Nem azért, mert nem működtek a részei, de „csak” azért, mert egyik egysége ritkán volt az adott feladatra megfelelő. Ez az egység pedig az oszlop volt, és persze ma is az lenne, ha a további fejlődés akkor megállt volna. De nem állt meg, sőt…

Az oszlop, azaz HPLC állófázisa csőben
Mielőtt erről a témáról belekezdenénk aktuális mondandónkba, tisztázni kellene, mit is nyertünk a HPLC-s technika kialakításával, a HPLC készülék(ek) megjelenésével. Ezt a kérdést persze nem a mai ismereteink és tapasztalataink segítségével kell megválaszolni. A kérdést és a választ is az 1970-es években aktív analitikus ismeretei és gyakorlata alapján fogjuk tárgyalni.

Egy elválasztástechnikai labor feladatai a múlt század 70-es éveiben alapvetően a következők voltak:
•          tisztaságvizsgálat (hatóanyag),
•          preparálás (hatóanyag, szennyezés),
•          stabilitásvizsgálat (hatóanyag),
•          azonosítás (hatóanyag, szennyezés).

Egy elválasztástechnikai labor lehetőségei a múlt század 70-es éveiben, a következők voltak:
•          spektroszkópia (VV, IR, NMR, MS).
•          kromatográfia (GC, TLC, LC).

Egy elválasztástechnikai labor problémái a múlt század 70-es éveiben (kromatográfia):
•          preparatív TLC: összességében nagyon munkaigényes és lassú technika,
•          preparatív GC: nem igazán volt használható,
•          analitikai GC: csak illékony anyagokra egyszerű,
•          analitikai TLC: lassú technika,
•          preparatív oszlop folyadékkromatográfia: munkaigényes és lassú technika, alacsony hatékonysággal.

Az előbbi felsorolás azzal a szándékkal készült, hogy kellő módon megmutassuk a HPLC készülék kifejlesztésének laboratóriumi – tehát gyakorlati – indokait.

Egy kromatográf – ami a sorozatunk alapján (is) nyilván minden kedves olvasónknak nyilvánvaló – a következő egységekből áll:
•          injektor,
•          pumpa (a GC-ben nincs),
•          oszlop,
•          termosztát,
•          detektor,
•          PC (feldolgozó/irányító egység), [eredetileg integrátor, vagy csak egy írószerkezet!]
Mielőtt bárki is kétségbeesne, hogy sorozatunkat újra elölről kezdjük, megnyugtatunk mindenkit, hogy ezt nem fogjuk tenni. Az előbbi felsorolásra adott témánk tárgyalásához van szükség. Mint ahogy a most következő kisebb részletezésre is.

Ha napjainkból visszatekintünk a múlt század 70-es éveinek elején megjelenő HPLC készülékek felépítésére, technikai színvonalára és képességeire, akkor többet és érdekesebbet teszünk az egyszerű nosztalgiázásnál. Mindenesetre azonnal megtalálhatjuk az akkor kialakított HPLC-s készülékek kritikus részeit (egységeit) és ezzel a technika – elméletileg is indokolható – Achilles-sarkait. (A HPLC-nek eredendően több is volt.) Ilyen volt az injektálás, a detektálás, és az adatkezelés és – de nem utolsó sorban – az állófázis az oszlopban.

Az egész folyadékkromatográfiát azonban körüllengte valami sejtelmesség, ami abban kulminált, hogy volt olyan analitikus, aki műanyag arcvédőben próbált meg dolgozni. De az egyébként tényleg megtörtént pajzshasználaton túl, mely inkább a vidám emlékek része, a múlt század 70-es éveire a műszerbeszerzések lehetetlen kaotikája és a keleti országokra vonatkozó részleges műszer embargó, a KOKOM-lista volt a jellemző. Így aztán a technika kezdetlegességein túl a beszerzés nehézségei is jellemezték a korszakot és a magyarországi viszonyokat. Az analitikának ekkor az ún. „tarhametria” is a része volt, mint az egészen speciális beszerzések tudományának területe. E sorok írója nem minden ok nélkül fogalmaz így. Az első analitikai HPLC-t éppen az 1974-es BNV-n kunyerálta, azaz „kérte el” kipróbálásra az angol kiállító cég képviselőjétől. Egy ilyen ideiglenes beszerzés azonban még nem jelentette a HPLC használatának biztos lehetőségét. Ehhez még két fázis – az álló- és mozgófázis – is szükségeltetett az adott és aktuális módszernek megfelelően…

E sorok írója itt és most nagyot sóhajt és tovább emlékezik. Szóval állófázis, és mozgófázis, azaz kromatográfiásabban mondva oszloptöltet és HPLC-s oldószer. Mielőtt thrillerré alakulna az elmélkedés, térjünk át gyorsan a dolgok elméletibb taglalására. Csak annyit teszünk hozzá még az előbbiekhez, hogy aki gyakran utazott kongresszusra, vagy ösztöndíjas volt valahol mint kromatográfus (jelölt), annak az állófázisa is több volt…

A HPLC gyorsabb, hatékonyabb és – a dolog természeténél fogva – automatizálhatóbb lehetősége volt a folyadékkromatográfia művelésének, mint a klasszikus oszlopkromatográfia, a gravitációs. Ez ma, 2008-ban persze több mint trivialitás. Elméletileg 1970-ben is az volt. De hát a gyakorlat. Egy HPLC készülék nem egyszerűen a műszeres változata volt egy töltött üvegcsőnek, a különbség elméletileg is nyilvánvaló volt. Aprítsuk tovább az LC állófázisát, és ezzel növeljük meg a technika hatékonyságát. Viszont így megnő a mozgófázis átáramoltatásához szükséges nyomás. Így aztán HPLC lesz a technika. Valami új módi a laborban. Ahogy sokan ezt – nyilván – 1970-ben gondolhatták.

Na de hogy is van azzal a HPLC állófázissal meg a „tokjával”, a HPLC-s oszloppal?

Az első kromatográfiás oszlop 300 mm hosszú és 3,9 mm átmérőjű volt, 10 µm-es szilika szemcsékkel megtöltve. Aztán 1973-ban megjelentek az 5 µm-es töltetek, és a szilanizált szilika töltetek.

Lassan azonban gyakorlatilag is nyilvánvaló lett, hogy a HPLC, az LC-hez képest:
•          hatékonyabb,
•          érzékenyebb,
•          gyorsabb,
•          automatizálható,
•          reprodukálhatóbb
kromatográfiás technika. A HPLC hatékonyabb, mert az állófázis szemcsemérete kisebb, mint amit az LC esetében használunk. Érzékenyebb, mert a hígulás az elválasztási folyamatban kisebb, mint az LC esetében. A HPLC nagyságrendekkel gyorsabb, mint az LC technika, mert a mozgófázisnak nem a gravitáció a hajtóereje. Automatizálható, mert műszerezett technika.

Az állófázis szemcseméretének a lényeges csökkentése miatt azonban a HPLC nem csak hatékonyabb az LC-nél, de a mozgófázis mozgatása lényeges túlnyomást igényel. Ezért része egy HPLC készüléknek a nagynyomású folyadékszállító pumpa. Hogy mennyi, az a felhasználható oldószerek számától, a HPLC kialakításától és a vevő anyagi lehetőségétől függ.

Egy HPLC módszer milyensége egyébként eredendően az állófázis és az alkalmazott detektor típusától függ.

A 70-es évek folyadékkromatográfiáját, vagyis az első generációs HPLC készülékeket bizonyos fokig a kezdetlegesség jellemezte. Bizonyos fokig, mert ez nem minden egységre egyformán volt jellemző. Így például az oszlop egységet az állófázisok korlátozott típusa jellemezte, mely a szilika kémia gyengeségének volt köszönhető. A detektorok is a kor színvonalát tükrözték, típusukkal és elektronikájukkal. Persze – és éppen ez értelmezésünk célja – mindezt mai szemmel megítélve. A detektorok között filter fotométerek és rácsos spektrofotométerek domináltak. Ami az állófázisokat illeti, a szilika gél dominált, ami miatt a normálfázisú elválasztás volt a majdnem egyeduralkodó technika. Amennyiben a fázist apolárissá kívánták tenni, a fázist apoláris szerves oldószerrel impregnálni kellett. Ez így azonban sem folyamatos, sem pedig megfelelően reprodukálható technika nem lehetett. Ennek az egyébként fordított fázisú technikának a létjogosultsága, igazán csak Halász István és Horváth Csaba munkássága eredményeképpen alakulhatott ki. A folyadékkromatográfia kiváló magyar szakemberei a szilikafázisok impregnálása helyett azok kémiai származékképzését dolgozták ki, olyan apoláris funkciós csoportokkal, mint C4, C8, C18, C22, fenil stb.

A fordított fázis esetén ezeket a kötött fázisokat vizes mozgófázisokkal együtt, illetve „szemben” alkalmazták, megteremtve ezzel a HPLC biológiai alkalmazásának az alapjait. Rövidesen poláris funkciós csoportok, mint CN, NH2, Cl, F reagáltatása is megtörtént a szilikával.

Amennyiben a HPLC technika fejlődését az állófázis szempontjából vizsgáljuk, illetve foglaljuk össze, akkor a következő állomásokat vagy inkább eredményeket említhetjük a körülbelüli kronológiájuk sorrendjében:
•          kémiailag származékolt szilikák megjelenése,
•          szemcseméret csökkentése, (10 µm › 3 µm),
•          különböző felépítésű és szerkezetű szemcsék előállítása,
•          műanyag szemcsék előállítása és bevezetése,
•          egyre stabilabb kötöttfázisok előállítása,
•          szén alapú állófázisok előállítása,
•          cirkónium alapú állófázisok előállítása,
•          királis funkciós csoportokkal rendelkező állófázisok előállítása,
•          pH stabil állófázisok előállítása,
•          hőmérséklet stabil állófázisok előállítása,
•          további szemcseméret csökkentés (3 µm › 1,8 µm),
•          nyomástűrő állófázisok előállítása.

Az állófázis milyenségében és minőségében bekövetkezett változások persze nem önmagukban voltak érdekesek, és nem is önmagukban történtek. A HPLC technikai fejlődésében – de nem kizárólag – az oszlop méreteinek az alakulásával hozhatók kapcsolatba. Ez egyéb más összefüggéssel együtt jelzi, illetve jelezte folyamatosan, hogy a HPLC tulajdonságai, részletei, mint például az állófázis szemcsemérete, az oszlop mérete(i) összefüggenek egymással. Ezt persze sorozatunk korábbi megfelelő részében részletesebben ismertettük. Most itt csupán ezen összefüggések – a fejlődéssel kapcsolatos – elemeit fogjuk megismételni.

Szemcseméret csökkentés okai és következményei:
•          Az elválasztás hatékonysága nő.
Ez az alapvető és elsődleges ok, de szerencsére igaz is, tehát következmény is.
•          Nő a mozgófázis mozgatásához szükséges nyomás.
            Nagynyomású pumpát kell használni.
•          Gyorsabb lesz az elválasztás.
            A feladatok megoldása is.

Ez a három következmény persze nem független egymástól – mint ahogy azzal sorozatunk korábbi részeiben részletesebben foglalkoztunk már – hanem összefüggenek egymással. Konkrétabban a szemcseméret csökkentés növeli az oszlopon kialakuló nyomást, növeli az adott töltethez (állófázishoz) tartozó optimális áramlási sebesség értékét, vagyis gyorsítja az elválasztást. Viszont a nagyobb áramlási sebesség megint csak nyomásesést növel. A hatékonyság növekedése viszont lehetővé teszi a rövidebb oszlop alkalmazását, ez pedig megint gyorsabb elválasztást okoz, miközben a nyomásesés a rövidebb oszlopon csökken.

Mindenesetre azt vegyük észre, hogy a „dolgok” az analitikai célzatú folyadékkromatográfiában elkezdtek csökkenni. Csökken az állófázis szemcsemérete, az oszlop mérete, a detektor cellatérfogata és persze ha figyelembe veszik azt, hogy a módszer érzékenységét a folyamat közbeni hígulások csökkentik, akkor az összes holttér nagysága is.

De ami a legfontosabb következmény: csökken(het) az injektált minta mennyisége. Ismételten hangsúlyozzuk, ez az analitikai célzatú folyadékkromatográfia igaza. A preparatívé értelemszerűen nem. Azaz nemhogy nem, hanem az ellenkezője igaz szinte.

A kromatográfiában a 80-as évekre újra jött egy nagy dobás. Egy újabb általános detektor, az MS bevezetése. Az MS vagy tömegspektorméter detektor. Megint követelmény a HPLC-vel szemben a GC-nek. Az interface kifejlesztésén túl az MS alkalmazását a GC-ben korábban kifejlesztett kapilláris oszlopok megjelenése tette lehetővé, illetve az a lényeges gyakorlati tény, hogy a GC-ben a mozgófázis az MS technikához alapvetően szükséges gázfázisban van. Eközben a HPLC technika szakemberei még mindig a technika gyengéit próbálják orvosolni. Az injektálás kialakítva, az állófázis állandó fejlesztés alatt, a detektálásban viszont megjelent az optika és elektronika közös újdonsága a fotodióda detektor (PAD), mely fordított optikai elrendezésével és fotódiódák segítségével on-line és folyamatos, mondhatni menet közbeni spektrumok felvételére – a számítógépes háttérrel pedig – azok tárolására (is) alkalmas. Ezzel tulajdonképpen a folyadékkromatográfia végleg kinőtt a gyerekkorból és „felnőtt” elválasztástechnikai módszerré vált. Aki – mint e sorok írója – részesült abban az élményben, hogy dolgozhatott olyan készüléken, amelynek diódasoros UV-VIS detektora volt, az bizonyára megérti az előbbi megállapítást. Nem maradhat el az a megjegyzés sem, hogy az 1980 körül megjelent 1090M HP készülék diódasoros változata a Pascal workstation-nal minden részében emlékezetes berendezés volt.

Ha az állófázisok fejlesztése, vagyis alakulása a HPLC megjelenése óta folyamatosan történt, akkor ez persze magára az egész készülékre is igaz. Mégis például a detektorok nagy fejlődése a fotódiódák alkalmazásának bevezetése után kezdődött, még akkor is, ha azzal tulajdonképpen nem volt kapcsolatban, mint például a különböző HPLC-s detektorok. A különböző HPLC-s detektorok fejlesztése talán a múlt század 80-as éveiben gyorsult fel igazán – és tekintettel arra, hogy ez alapkérdése, problémája a HPLC technikának (is) – természetesen a mai napig tart. Eközben a különböző tudományok művelői egyre nagyobb vérszemet kapva szállították az összetettebbnél összetettebb mintákat, egyre komolyabb kérdéseket mellékelve azokhoz. Az elválasztástechnika igyekezett állni a próbákat. Előbb az elválasztás folyamata alakult szükség esetén több dimenzióssá, aztán a detektálás. Ez utóbbi a kromatográfia és spektroszkópia közös „vállalkozása” volt, illetve lett. Az 1990-es években egymás után alkalmaztak és írtak le ilyen módszereket. HPLC-MS, HPLC-NMR, HPLC-IR, HPLC-ICP stb. kapcsolt készülékekkel végeztek analitikát olyan mintákon, amelyek igényelték az adott spektroszkópiai detektálást.

Aztán a biológia tudománya felismerte saját meglévő ismerethiányát és megindította saját megújulását. Ezzel mintegy „kibérelte” az analitika jelentős területét, a HPLC-t is. Korábban Halász István és Horváth Csaba nevével fémjelezve említettük az apolárisra kémiailag származékolt állófázisok megjelenését, mint a HPLC-s technika olyan fejlesztését, amely lehetőséget teremtett vizes minták – minden korábbinál jobb – analízisére, komponenseinek elválasztására. Ha azt mondjuk, hogy a XX. század többek között a biológia évszázada volt, akkor azt is mondhatjuk, hogy ebben az analitikának egyre nagyobb szerepe lett. A múlt század 80-as éveitől kezdve ezt a szerepet a HPLC technikája is vállalta. Persze vállalnia kellett, mert ezt a folyamatos fejlődést egyrészt aktiválta, másrészt indokolta.

A biológia azonban manapság nem növény- és állattant jelent. Talán helyesebb is ma már élettudományt emlegetni. Ez minden olyan terület összessége, ami az élettel kapcsolatos. Orvostudomány, gyógyszerkutatás, sejtbiológia, környezetvédelem, élelmiszertudomány, élelmezéstudomány stb., hogy csak a legismertebbeket említsük. Ezen területek analitikai feladataihoz kell a HPLC technikájának elválasztástechnikai „kollégáival” felnőni, és azokat megoldani.

A HPLC technika a XXI. Században
Az élettudomány különböző területeinek nagy és izgalmas kérdései jellemzik a világunkat mostanában. Az elmúlt évtizedben igencsak. Ezek megfelelő megválaszolásához – meg hát úgy általában is – a HPLC technikája már a múlt század 80-as éveitől kacérkodott a tömegspektrometriával. Egyúttal „irigykedett” is a GC technikájára emiatt. A korai, nem igazán sikeres – inkább kierőszakolt – próbálkozások után, az ezredfordulóra piacképes, jól használható kapcsolt technika lett a HPLC-MS. Miközben nem kívánjuk elfelejteni a HPLC korábbi detektorait (használjuk is őket, már csak az „Ágyúval verébre?” kérdés okán is), kijelenthetjük, hogy ma már az MS detektor a „menő” a HPLC technikájában. Állítjuk ezt pedig azért, mert a HPLC-MS kapcsolat olyan interface-ek „birtokába jutott”, amelyekkel különösen – de persze nem kizárólag – az élettudományok megfelelő analitikai eszköze tud lenni. Ennek a kapcsolt technikának a kialakításához azonban a HPLC technikájának igencsak át kellett előbb mennie bizonyos átalakulásokon. Szerencsére ehhez megvolt a technikai háttér.

A tömegspektrometriában gázfázisú ionokat analizálunk. A vizsgálandó anyagoknak tehát nem egyszerűen ionos állapotban, de gázfázisban is kell lenniük. A gázfázisú ionok kialakulását sok minden zavarja, de a HPLC mozgófázisa igencsak az analízist is. Ezért szükség volt/van a mozgófázis eliminálására. Ennek végül is az a legjobb megoldása, ha eleve kevesebb mozgófázist használunk. A 46.l táblázatban ennek az elképzelésnek a gyakorlati adatai láthatók. Az oszlop méreteinek a csökkentése – a dolog természete miatt – nemcsak az egyébként környezetszennyező oldószerek kibocsátását csökkenti. Csökken az injektálandó minta mennyisége is. Nő viszont – mint említettük – a módszer érzékenysége és az analízis sebessége. Ha MS-t használunk detektorként ez többszörös haszon, mert az eleve a legérzékenyebb és leggyorsabb ilyen módszer. Persze ezen kívül általános is, és persze szerkezetazonosító, felderítő is.

Ezek után nézzük meg azokat a felmérési adatokat, amelyek az ezredfordulón készültek a HPLC aktuális technikai és gyakorlati állapotáról, használatáról. A felmérések alapján a kérdésekre adott válaszokat százalékosan vetették össze (46.1 – 46.8 diagram).

Eddigi aktuális elmélkedésünk alapján megállapíthatjuk, hogy a HPLC technika fejlődésében a folyamatosság ellenére is több nagy lépés, korszakalkotó esemény történt.

A közel négy évtized, amely a HPLC megjelenése óta eltelt, igencsak nem volt unalmas. És az aktuális mai események sem azok. Mert vannak. Ezek nem méretes események, mégis nagyok egy kromatográfus számára (is). Sorozatunk eddigi 45 részében igyekeztünk egyszerű magyarázatokkal, indokokkal bevezetést adni a HPLC rejtelmeibe. Most itt az előbbi rövid történeti áttekintés után, még egyszer kiemelve a fejlődés leglényegesebb állómásait, szeretnénk végre poénosan visszalépni a mába, a HPLC jövőjének már nem is az előszobájába, de a „technikai boszorkánykonyha” belsejébe.

Megjelent tehát valamikor – mint említettük – a múlt század 70-es éveinek az elején, egy új kromatográfiás technika, a HPLC. Úgy „majd csak lesz valami” alapon. Aztán a tudomány a technikai háttér fejlődésének a hatására „vérszemet kapott” és egyre jobban követelte a további fejlődést. Ebben a biológia – vagy ahová a terület mára bővült: az élettudomány – járt, és jár ma is az élen. A HPLC technikája pedig aranyhalként igyekszik teljesíteni a „halászok” igényeit.

A „halászokat” pedig az életünk minél tökéletesebb megismerése vezérli. A HPLC mára a genomika, a proteomika, metabonomika, klinikai kémia egyik legkomolyabb eszköze lett. Hogy ez ma így van, abban szerepe van annak, hogy először az állófázisok kínálata lett teljesebb, aztán a detektoroké. Ezekről, a korábbi részekben volt már szó részletesebben. Persze amikor részekre bontjuk a HPLC technikai fejlődését, akkor leegyszerűsítjük a történetet, mert az állandó és a különböző területek fejlődése nem zárja ki egymást. Sőt! Mégis azt kell mondanunk, hogy amikor már volt jó sok állófázis a HPLC estében (is), egyre jobban hiányzott az igazi „mindenre alkalmas detektor” a technikában. Lett, mert lennie kellett már nagyon. Az MS detektor – persze végre a folyadékkromatográfinak megfelelő módon – kapcsolódhatott a HPLC elválasztó egységéhez. Megfelelően, vagyis az erre a célra kitalált interface-en keresztül. Erről is volt szó korábban.

A tömegspektrometria készülékei azonban nemcsak általános, de nagyon érzékeny detektorok is

Érzékenységük azt jelenti, hogy nem szükséges „csurig tölteni őket”, sőt ezt nem is nagyon szeretik. Az interface-ek leginkább nem. Kíméljük hát meg őket a sok mozgófázis és minta negatív hatásától. Használjunk aprócska HPLC-t. Úgyis ez a fejlődés iránya. Aztán az élettudomány mintái sem liternyiek. Mint ahogy megállapítottuk már többször is korábban, az állófázis szemcseméretének a csökkenése lehetővé teszi, hogy a „tok” is kisebb legyen. A tok, azaz estünkben a kromatográfiás oszlop tehát szépen kezdett egyre kapillárisabb és rövidebb lenni. Ezzel még gyorsabb is lett az elválasztás. De hát az direkt jó, hiszen a tömegspektrometriás detektorok sem lassú berendezések. A mikrotechnika is fejlett már!

Jaj hova is jutottunk a meditációnkkal? Hát a HPLC mikrokromatográfiai változatának az indoklásához. Ami mint a diagrammokból látható, már meg is született. Az újszülöttet aztán méretei és kiképzése alapján – eléggé természetesen – chip készüléknek nevezték el.

(Folytatjuk)

A fentiek Dr. Szepesi László tiszteletére íródtak. (Köszönjük.)
Pásztor József