Bemutatkozás/Labinformálódás/Kromatográfia sorozat 42.rész



Mintaelőkészítés felsőfokon. A nagy hatékonyságú (nyomású) folyadékkromatográfia (HPLC) 42. rész: Bináris kromatográfia.

Azonos forrásból származó nyers vizsgálati minták sorozatos injektálása során – bizonyos mennyiségű injektálás után – nem ritka, hogy az addigi alapvonal egyre elfogadhatatlanabbul zajossá válik. Folytatva az injektálásokat ez fokozatosan erősödik, mígnem az addigi csúcsok hatalmas „alapvonalpuklik” áldozatává, és gyakorlatilag értékelhetetlenekké nem válnak. Ez nemritkán a teljes eltűnésükkel is együtt jár.

Mi történt tulajdonképpen?
A nyers minták szennyezései a kromatográfiás oszlopon (álló-fázison) szép lassan – de a sorozatos injektálásokkal folyamatosan – feldúsulnak. Lévén azonban egy HPLC oszlop „fekete doboz” (is), ez csak akkor derül ki, amikor az álló-fázison lerakódott anyagmennyiség egyszer csak át nem tör az oszlopon. Ezután az oszlop egyfolytában „termelni” kezdi a HPLC rendszer hatékony működését akadályozó anyagot vagy anyagokat, illetve az azok által kiváltott zavaró detektorjeleket. Mindezen jelenségek megelőzése érdekében szokás a zavaró szennyezéseket nagy valószínűséggel tartalmazó nyers analitikai minták folyadékkromatográfiás vizsgálata esetén ún. előtétoszlopot alkalmazni, vagyis az injektor és a sorbarendező oszlop között használni. Kromatográfus zsargonnal, az injektor és a kromatográfiás oszlop közé bekötni. Miután az említett előtétoszloppal nem a sorba rendezésünk, elválasztásunk dimenzióját kívánjuk növelni, ezért annak töltetét (álló-fázisát) az elválasztó oszlopéhoz azonosan kell megválasztani. Anyagát és funkciós csoportját tekintve feltétlenül, míg méretét, a töltet dp-jét azonosnak vagy valamivel nagyobbnak tervezhetjük, hogy gyakori kicserélése ne járjon túl nagy anyagi ráfordítással.
A két oszlop összekötésénél még azt is figyelembe kell venni, hogy azzal a korábban kialakított – és lehetőleg minimalizált – holtteret ne növeljük meg túlságosan. Az előtétoszlopot azért alkalmazzuk, hogy az injektált minták szennyezését, szennyezéseit annak álló-fázisával felfogjuk, és így azokat ne engedjük a kromatografáló oszlopra jutni. Az előtét- vagy angolul guard-, (védő-)oszlopnak is nevezett kromatográfiás kiegészítő egységet azonban – funkciójának megfelelően – célszerű gyakran cserélni. Pontos mérésre persze szinte soha nincs idő, de mint védőoszlop sohasem célszerű megvárni, hogy a megkötött szennyezés, illetve szennyezések telítsék, és így a következő injektálás a kromatográfiás oszlop álló-fázisát (is) veszélyeztesse. Ezért említettük korábban, hogy az előtétoszlop töltetének a szemcsemérete legyen nagyobb – és ezért olcsóbb – az elválasztó oszlop szemcseméreténél. Ez azonban elsősorban tényleg csak anyagi kérdés, nem pedig elméleti. Az előtétoszlop használata ugyanis nem növeli meg lényegesen az álló-fázison bekövetkező nyomásesést. Az előtétoszlop önállóan rövid oszlop vagy cartridge – az elválasztó oszlophoz közvetlenül, kapilláris nélkül köthető – formában létezik, és mindkét kivitelezésében gyakran cserélendő egysége egy kromatográfnak. Ezzel általában a nem túl olcsó kromatográfiás oszlop, azaz az álló-fázis működését hosszabbítjuk meg.
De mi van akkor, ha az analitikai minta szennyezése vagy szennyezései nemhogy nem szennyezések, de még csak nem is hatalmas mennyiségűek?
Tegyük ugyanezt! De most már éppen a feldúsítás előre kitervelt szándékával.
Ezen a helyen – minden további félreértés elkerülése végett – kénytelenek vagyunk közölni a Kedves Olvasóval, hogy eddig is, és a továbbiakban is, egy vizsgálati anyag szennyezésének azt nevezzük, amely a kromatográfiás készülék szempontjából annak számít, tehát jelenlétével gátolhatja megfelelő működését. Ezzel a talán kissé önkényes megközelítéssel azonban nyilvánvalóbbá igyekszünk tenni a korábban „minta-előkészítés I.”-nek nevezett analitikai lépés szándékait.

Egy kromatográfiás módszer célját tekintve olyan sorba rendezés, amely a kivitelezhető – komponensenkénti – detektálás, vagyis analitikai mérések érdekében szükséges. Az elválasztási folyamat, folyamatok összessége azonban egyúttal hígítás is! Így azután egy kromatográfiás eljárás kialakítását két alapvető folyamat, úgymint a különböző áramlások, vagyis a szelektivitásért felelős mozgások és a hígulásért felelős mozgások vetélkedése jellemzi. Az oszlopban (álló-fázison) eltöltött idő növelésével (retenció) javítható (növelhető) a szelektivitás. Ezzel azonban megnöveljük a hígulás idejét (is) vagyis nagyobb lesz az egyúttal, helyesebben ez idő alatt létrejött hígulás mértéke is, csökkentve ezzel az adott komponens, illetve komponensek detektálásának a jóságát, azaz növelve (rontva) azok kimutatási/mennyiségi határát. A retenció azután az álló-fázis/mozgó-fázis viszonyának a „megfelelő” kiválasztásával olyan mértékben növelhető valamely mintakomponens vagy mintakomponensek esetében, hogy azok a kromatografálás ideje alatt meg sem jelennek a detektorban, vagyis nem hagyják el az oszlopot (álló-fázist). Ezzel szemben áll az a kromatográfiás jelenség, amikor a vizsgált minta adott komponense, illetve komponensei semmiféle vagy csak igen csekély affinitást mutatnak az alkalmazott álló-fázis iránt, vagyis gyakorlatilag az injektálás után teljesen, vagy majdnem teljesen a mozgó-fázis sebességével távoznak az oszlopról. Az előbbiekben a kromatográfiás folyamatok két olyan végletéről tettünk említést, amelyek a sorba rendezés során mindenképpen elkerülendők, de egyébként bekövetkezhetnek. A teljesen az álló-fázison és a teljesen a mozgó-fázisban maradás jelenségeit említettük tehát. Így amikor az álló-, illetve mozgó-fázis megfelelő kiválasztásának említésénél a megfelelő jelzőt idézőjelbe tettük, azt azért tettük, hogy a jelző sztereotip jellegét domborítsuk ki. Az említett jelenségek ugyanis a kromatográfiában kerülendőek, ezért bármelyik esemény bekövetkezése hibás fáziskiválasztásra utal. Nem az viszont – érthető okokból – a minta-előkészítés I. esetében. Mert ebben az esetben ezeknek az eseményeknek használható következményei vannak. Amennyiben pedig mindkét jelenséget valamelyik kromatográfiás fázis (akár az álló, akár a mozgó) szempontjából nevezzük el, illetve jellemezzük, akkor azt tulajdonképpen az igen és a nem szavakkal tehetjük meg. Az oszlopon maradás szempontjából például az igen a teljes maradás, a nem pedig a gyors távozás jellemzője. A távozás szempontjából pedig fordítva. Ennek a megközelítésnek az okán beszélhetünk azután igen-nem, vagyis „bináris kromatográfiá”-ról. A bináris kromatográfiában tehát nem a sorba rendezés a lényeg (persze nem lényegtelen!), hanem a kérdéses mintakomponensek affinitásának a létezése vagy hiánya, adott álló-fázishoz, az alkalmazott álló-/mozgó-fázis viszony függvényében. Persze ez így pusztán a végső leegyszerűsítése annak a folyadékkromatográfiás technikának, amit binárisként jellemeztünk az előbbiekben. Azt is mondhatjuk, elsősorban tendenciózus megállapítást tettünk. De hát ez is „csak” egy kromatográfiás módszer, definiált álló- és mozgó-fázissal, vagyis a szelektív megoszlás jelenségével. Ennek következtében az adott elválasztástechnikai feladat és az ennek megfelelően megválasztott fázisok alkalmazása esetén lehetséges különböző frakciók gyűjtése (is), a retenciós idők függvényében. Azonban a bináris kromatográfiában elsődlegesen mégiscsak az a kérdés – például az álló- fázisra nézve –, hogy egy adott mintakomponens marad vagy megy, azaz igen vagy nem.

Egy vizsgálati anyag komponenseinek a jellemzése
Egy anyag, amelyet az analitikai vizsgálat szándéka miatt vizsgálati anyagnak nevezünk, a mintavétel során és segítségével vizsgálati mintává „egyszerűsödik” /Labinfó XVI, 2007. (2) 29./ Az egyszerűsödik szót azért tettük idézőjelbe, mert egy jól végzett, tehát megfelelő mintavételezés során a vizsgálati anyag csak és kizárólag összmennyiségében változik, változhat, tehát csökkenve alakul vizsgálati mintává. A vizsgálati minta összetételének azonban hasonlítania kell a vizsgálati anyag összetételére. A mintavételezés jóságát/helyességét éppen azzal jellemezhetjük, hogy ez bekövetkezett-e vagy sem. Vannak azonban esetek, amikor ez eredendően nem következhet be. Ezek az esetek a vizsgálati anyag különböző fokú inhomogenitásával kapcsolatosak. Ilyenkor vagy homogenizálást végzünk a vizsgálati anyagon, vagy pedig különböző helyekről veszünk vizsgálati mintát, ellátva azokat a mintavételezés helyének  megjegyzésével. Az előbbi lehetőségre ólomszennyezett paprikaőrlemény vagy porított tabletta vizsgálata, de általában kis mennyiségű vizsgálati anyagok esetei lehetnek a példák. Utóbbira talajminták vételezése a legismertebb példa. A vizsgálati anyag és így a vizsgálati minta halmazállapotát tekintve – a dolog természeténél fogva – szilárd, folyadék vagy gáz halmazállapotú lehet. A vizsgálatokat azonban, amelyek szinte minden esetben analitikai jellegűek, és főleg az összetétel megállapítására vonatkoznak, leginkább – de nem kizárólag – folyadék halmazállapotban végzik el. Az analitika ma már azonban nemcsak gázhalmazállapotban lévő mintákat (pl. GC/TID) képes közvetlenül vizsgálni, de szilárd mintákat (pl. röntgen- vagy γ-fluoreszcencia jelenség) is.

Egy összetett analitikai minta komponenseinek a vizsgálata azonban – mint említettük – folyadék halmazállapotban a legelterjedtebb, különösen akkor, ha a vizsgálatra a kromatográfia valamelyik ágát használjuk. A kérdés tehát most már az, hogy a három létező halmazállapotban előforduló különböző vizsgálati anyagból hogyan tudunk folyadék halmazállapotú vizsgálati mintát előállítani, és az előállítás során mennyire tudjuk biztosítani a változatlan összetételt. Amennyiben ez utóbbi nem lehetséges, akkor hogyan tudjuk követni az eredeti vizsgálati anyag összetétel-változását a minta-előkészítés során?

A szilárd halmazállapotú vizsgálati mintákat az előbbiek alapján aszerint osztályozhatjuk, hogy milyen módon és milyen mértékben vihetők oldatba. Ennek megfelelően egy szilárd minta:
•          teljes egészében
vagy
•          részlegesen
vihető oldatba. Az előbbi esetben megfelelő oldószer kiválasztásával és alkalmazásával végrehajtható az oldatba vitel. Amennyiben a keletkezett oldat semmiféle oldhatatlan részt nem tartalmaz, úgy a vizsgálati anyag minden komponensét tartalmazza a vizsgálati minta. Az utóbbi esetben a vizsgálati minta előállításához valamilyen extrakcióra van szükségünk. Ez lehet „egyszerűbb esetben” szobahőmérsékletű és légköri nyomású szilárd-folyadék, „durvább esetben” magasabb hőmérsékletű szilárd-folyadék, nagyon erős kötődések esetén pedig szilárd-szuperkritikus fluid extrakció. Részleges oldatbavitel esetén a keletkezett extraktumok további vizsgálata kizárólag adott komponensek célzott mérése, illetve meghatározása lehet. Az alkalmazott extraháló oldószert, oldószerelegyet, valamint az extrakció körülményeit is ennek megfelelően kell kiválasztani. Ez különösen a szuperkritikus fluidummal történő extrakció esetében lényeges, illetve lehetséges.

Eredendően, a folyadékhalmazállapotú vizsgálati anyag kezelése is függ – amint korábban a szilárd halmazállapotú vizsgálati anyagok mintavételezésénél már említettünk – az anyag homogenitásától. Ez folyadékhalmazállapot esetén vonatkozhat az anyag fázisaira és/vagy nem feloldott (esetleg kicsapódott) összetevőire. Ezekben az esetekben ismét valamilyen extrakció, jelen esetben főleg a folyadék-folyadék extrakció alkalmazása kerülhet előtérbe. Ezzel azonban megint az a helyzet, hogy alkalmazásával „csak” tervezett szelektív vizsgálatokra alkalmas vizsgálati mintát alakíthatunk ki. Amennyiben a folyadék halmazállapotú vizsgálati anyag mindenképpen homogén oldatnak tekinthető, akkor szükség esetén a vizsgálati minta folyadék-szilárd extrakcióval tehető analizálható mintává.

Általában egy anyag, így egy vizsgálati anyag is, lehet tiszta, egykomponensű – amennyire ilyen egyáltalán létezik, illetve előállítható, mint például egy gyógyszerhatóanyag –  és több komponensű, ami általában jellemzi a körülöttünk lévő világ anyagait, képviselőit, függvényében annak, hogy mit is tekintünk konkrétan egy anyagnak. A komponensek mindkét esetben a kérdéses vizsgálat szempontjából lehetnek érdekesek vagy érdektelenek. Az előbbi esetben például minden lehetséges komponens, ezért, hogy eldönthessük, illetve igazolhassuk, hogy a kérdéses vizsgálati anyag valóban tiszta-e, és ha igen, akkor mennyire, és ha nem, akkor mennyire nem. Ebben a példában sokszor a kimutatási határ közelében lévő nyomnyi komponensekről kell kimutatni a létezésüket vagy a hiányukat. Ezek a nyomnyi anyagok a minta szempontjából tulajdonképpen szennyezések, de mint korábban megállapítottuk, az analitikai mérés szempontjából viszont a mérendő komponensek, tehát nem szennyezések.

42.1_tablazat

42.1 táblázat

A többkomponensű vizsgálati anyagok a kérdéses analitikai vizsgálat szempontjából érdekesek vagy érdektelenek lehetnek. A kettéválasztás ilyen indokkal nem igazán pontosan fejezi ki az általános helyzetet. Kifejezőbb, ezért helyesebb egy minta komponenseit mérendő, illetve nem mérendő jelzővel illetni, illetve ennek alapján felosztani. Azért nem mondhatjuk, hogy érdekes vagy érdektelen, mert egy komponens akkor is érdekes lehet, ha mérni, vizsgálni egyébként nem kell, de a kidolgozott mérés, illetve sorba rendezés kivitelezését jelenlétével zavarni fogja. Persze ilyenkor az említett érdekesség negatívnak tekinthető.

Ugyanakkor a mérés szempontjából érdekes komponens vagy komponensek mérése, mennyiségi jelenlétük okán az előbbi példához hasonlóan problémákat vethet fel, amennyiben a vizsgálati anyagban mutatott mennyiségük nemcsak a meghatározásokhoz, de a kimutatásokhoz sem elegendő, mert azok alatta vannak az alkalmazandó detektorhoz rendelhető meghatározási, illetve kimutatási küszöbértékeknek, határoknak. Egy vizsgálati minta komponenseit az analitikai módszer igényei (megfogalmazása) szempontjából a 42.1 ábrán vázoltuk fel. Az ábra kapcsán ismételten hangsúlyozni kell, hogy nem a vizsgálati anyag összetétele, hanem a hozzá tartozó vizsgálati módszer igényei alapján ábrázolja és osztja fel a vizsgálati anyag komponenseit.

68513ab3046672d918563f19aa4cd484

42.1 ábra

42.1 ábrán egy vizsgálati anyag sematikus összetételét ábrázoltuk, az analitikai feladat (mérési módszer) nézőpontjából. Mint azt az előzőekben már vázoltuk, egy vizsgálati anyag és vizsgálati minta – a mérés szempontjából – alapvetően kétféle, úgymint mérendő és nem mérendő komponenseket tartalmazhat. A mérendő komponensek mennyiségük alapján fő- és mellékkomponensek lehetnek. A főkomponens(ek) mennyisége lehet túlságosan nagy, míg a mellékkomponensek között lehetséges túlságosan kis mennyiségű. A nem mérendő komponenseket a minta mátrixának is szokás nevezni, és nem ritka esetben bensőséges kapcsolatban lehetnek a minta mérendő komponenseivel. Felosztásukat aszerint végeztük, hogy zavarják-e vagy nem zavarják az analitikai módszert.

Ezek szerint egy adott analitikai feladat zökkenőmentes, egyértelműen reprodukálható kivitelezéséhez általában két lehetséges alapprobléma megoldását szükséges elvégezni a minta-előkészítés szintjén. Ezek pedig az eddigiek alapján:
1. tisztítás,
és/vagy
2. dúsítás.

Ad. 1. A tisztítás azoknak a nem mérendő komponenseknek a kinyerésére szolgál, amelyek jelenléte a sorozatmérések esetén vagy azonnal vagy előbb-utóbb lehetetlenné teszik a korábban kidolgozott módszer megfelelő kivitelezését. Ezeket a komponenseket mi önkényesen, de annál következetesebben az analitikai műszer szennyezéseiként említettük. A minta összetételének nézőpontjából ezeket a nem zavarókkal együtt szokás a minta mátrixának nevezni. Mint azt korábban többször is megállapítottuk, a vizsgálati anyag → vizsgálati minta → analizálható minta kialakítási sorrendben a tisztítás a második nyíllal jelölt átalakítás egyik feladata kell hogy legyen, szükség esetén végrehajtására több lehetőség is létezik.

Ad. 2. A dúsítás feladata azokra a mellékkomponensekre vonatkozhat, illetve vonatkozik, amelyeknek a mennyisége nem haladja meg az adott detektorhoz és komponens(ek) szerkezetéhez rendelhető kimutatatási határt, illetve küszöbértéket, ugyanakkor jelenlétük már ezekben a mennyiségekben is káros következményekkel járhat. Tehát mind a kimutatásuk, mind pedig meghatározásuk alapvető fontosságú. Ebben, illetve ezekben az esetekben az analitikusnak törekednie kell minél kisebb mennyiségre is reagáló detektorral és a dolog természeténél fogva minél rövidebb retencióval vizsgálni a kérdéses komponenst, komponenseket. Nem kevés esetben azonban az analitikus kénytelen elefántot csinálni a bolhából, vagyis sorba rendezés előtt dúsítani a „bolhányi” mennyiségeket.

Amikor ezeket az előbb tárgyalt minta-előkészítési feladatok megoldását tárgyaljuk, nem szabad napjaink egyik legfontosabb szempontját figyelmen kívül hagyni, ami nem más, mint a kivitelezések automatizálhatósága. Amikor ezt a szempontot is figyelembe vesszük, akkor az előbbi feladatok kivitelezésére elég egyértelműen a szilárd fázisú extrakció, más néven vagy inkább szisztematikusabban elnevezve, a folyadék-szilárd extrakció (angol rövidítéssel: SPE) a legalkalmasabb.

A szilárd fázisú extrakció (SPE) szakmailag a klasszikus oszlop-folyadékkromatográfia leszármazottjának tekinthető. Lehetőségeit azonban már a terület mai színvonalán és fejlődésével valósíthatjuk meg. Tulajdonképpen ma a természetes eredetű analitikai minták kezelése szinte el sem kepzelhető az SPE valamilyen alkalmazása nélkül. Részletesebb tárgyalására még visszatérünk.
Az SPE főbb jellemzőit a 42.1 táblázatban foglaltuk össze.

(Folytatjuk)
Pásztor József

Regisztráció
HÍRLEVÉL REGISZTRÁCIÓ
Keresés
Mit:
Hol:
gyogyszercimke Chemgeneration